李 萍，方 霞，曹雨娜，陆惠娜，梁爱斌，张 虹

    ·论著·

    卷曲螺旋结构域蛋白74B对纤毛生成和细胞周期调控作用研究

    李 萍，方 霞，曹雨娜，陆惠娜，梁爱斌，张 虹

    【摘要】背景卷曲螺旋结构域蛋白(CCDC)参与基因转录、细胞凋亡及细胞周期过程，并调控恶性肿瘤细胞的侵袭和转移等多种生物学行为，然而多数CCDC的生物学功能目前尚未明确。目的探讨CCDC74B的细胞定位及对纤毛生成和细胞周期的影响。方法2013年3—9月通过构建在人视网膜色素上皮(RPE1)中的Tet-On表达系统,实现CCDC74B在细胞内的蛋白表达,然后通过细胞免疫荧光染色观察CCDC74B的细胞定位，通过小干扰RNA(siRNA)转染敲除CCDC74B在RPE1细胞中的表达，分为对照组、siRNA#1组、siRNA#2组，采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测CCDC74B mRNA 表达水平；采用细胞免疫荧光染色及流式细胞术观察下调CCDC74B表达后纤毛生成情况和对细胞周期分布的影响。结果在正常上皮细胞中，CCDC74B位于中心体，细胞免疫荧光染色示，下调CCDC74B表达后细胞初级纤毛生成。siRNA#1组及siRNA#2组转染后36 h及48 h纤毛生成率分别高于对照组(P

    2结果

    2.1细胞免疫荧光染色观察CCDC74B细胞定位在RPE1细胞中成功构建了表达带有Myc标记的人类基因CCDC74B(Myc-CCDC74B)的Tet-On表达系统。使用DOX(25 ng/ml)预处理24 h，在诱导Myc-CCDC74B在RPE1细胞中蛋白表达后,使用抗tubulin抗体与抗Myc抗体进行双重细胞免疫荧光染色观察到CCDC74B的绿色荧光与tubulin的红色荧光重合而变色，提示CCDC74B在细胞分裂间期位于中心体(见图1，本文图1～4彩图见本刊官网www.chinagp.net电子期刊相应文章附件)。

    2.2下调RPE1细胞中的CCDC74B表达对细胞纤毛生成的影响细胞免疫荧光染色示，下调CCDC74B表达后细胞初级纤毛生成(见图2)。siRNA#1组及siRNA#2组转染后36 h及48 h纤毛生成率分别高于对照组，差异有统计学意义(P

    图1细胞免疫荧光染色观察Myc-CCDC74B Tet-On RPE1细胞中CCDC74B细胞定位 ......