陆晓华，郑亚莉，张 霞，李 博，保 莉，罗红艳，曹 丽，鄂 静，张 彬，毕逢辰

    ·论著·

    周期素依赖性蛋白激酶5过度活性与肾小球足细胞凋亡的关系研究

    陆晓华，郑亚莉，张 霞，李 博，保 莉，罗红艳，曹 丽，鄂 静，张 彬，毕逢辰

    目的通过在肾小球足细胞中转染p25基因，探讨周期素依赖性蛋白激酶5(Cdk5)的活性对足细胞结构及功能的影响。方法2014年度，于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中培养分化成熟的小鼠离体足细胞，将足细胞分为对照组、空转染组和p25转染组。应用pAdTrack-CMV病毒载体克隆p25基因，并转染足细胞，48 h收集细胞；采用Western blotting法测定Cdk5、p25、p35及细胞凋亡相关蛋白Cleaved caspase3的表达水平；应用免疫沉淀和同位素γ-32P标记法测定Cdk5活性；足细胞免疫荧光化学染色，观察Cdk5、p35在足细胞中的表达，以及足细胞Actin的排列情况。结果HEK293细胞Cdk5表达阳性，p35表达阴性，肾脏皮质、足细胞和肾小球中均有不同程度的Cdk5和p35的表达。对照组和空转染组p25表达阴性，p25转染组p25表达阳性。各组细胞凋亡相关蛋白Cleaved caspase3表达水平和Cdk5活性比较，差异有统计学意义(P1 材料与方法

    1.1抗体和试剂分化成熟的小鼠离体肾脏皮质、足细胞和肾小球标本(美国国立卫生研究院，国家糖尿病、消化系统病和肾病研究所Dr.Jeffrey Kopp实验室提供)，HEK293细胞(美国Cayman公司)，抗Cdk5抗体(1∶1 000或1∶100)、抗p35抗体(1∶1 000或1∶100)、抗WT1抗体(1∶2 500，美国Santa Cruz公司)，抗Cleaved caspase3抗体(1∶1 000，美国Cell Signaling Technology)，抗Tubulin抗体和抗β-actin抗体(1∶3 000或1∶500，美国Sigma公司)，Roscovitine(美国ChEMBL公司)，Lipofectamin 2000基因转染试剂、DMEM培养液(美国Invitrogen生命技术公司)，胎牛血清(美国Hyclone公司)。

    1.2方法

    1.2.1细胞的培养及分组2014年度，参考文献[2]体外培养分化成熟的小鼠离体足细胞,将细胞培养在胶原Ⅰ涂层的培养瓶或培养皿中，培养基为含10%胎牛血清的RPMI 1640，加入2 mmol/L谷氨酰胺，10 mmol/L HEPES液 ......