何虎强，曾 宏，孙晓磊，张 雷，王伟明，胥雄飞，何延政，刘 勇

    ·论著·

    晚期糖基化终末产物调控平滑肌细胞钙化的机制研究

    何虎强，曾 宏，孙晓磊，张 雷，王伟明，胥雄飞，何延政，刘 勇*

    目的 探讨晚期糖基化终末产物(AGEs)调控其受体促进人股动脉平滑肌细胞钙化的机制。方法 2014年1月—2015年3月，将股动脉中膜平滑肌层剪成1～2 mm组织块培养，选取3～8代平滑肌细胞用于实验。将平滑肌细胞分为4组，A组单纯于DMEM培养基中培养，B组于含10 mmol/L β磷酸甘油钠的DMEM培养基中培养，C、D组分别于含10 mmol/L β磷酸甘油钠的DMEM培养基中加入20、40 mg/L AGEs，各组平滑肌细胞干预培养96 h。合成3对随机AGEs受体(RAGE)siRNA，以50 nmol/L转染C组平滑肌细胞，24 h后进行siRNA沉默效果检测，选取转染效率较高的序列用于实验。分别取转染前后平滑肌细胞，采用Von Kossa染色实验观察平滑肌细胞内钙沉积情况，采用Western blotting法检测RAGE、β-catenin、骨保护素(OPG)表达水平。结果 未转染的平滑肌细胞中，A组无钙化斑块形成，B组可见明显的钙化斑块；C、D组细胞质、细胞核呈现粉红色的数量增加，钙化斑块明显增多。经转染后，C组平滑肌细胞细胞质、细胞核呈现粉红色的数量较未转染细胞减少，钙化斑块形成受到抑制。未转染的各组平滑肌细胞RAGE、β-catenin、OPG表达水平比较，差异均有统计学意义(P1 材料与方法

    1.1 主要试剂 DMEM培养基、胎牛血清(美国HyClone公司)，DAPI染液(美国Sigma公司)，肌动蛋白α(α-SMA)单克隆抗体(美国Bioworld公司)，羊抗兔异硫氰酸荧光素(FITC)标记二抗(武汉博士德生物工程有限公司)，山羊封闭血清(北京博奥森生物技术有限公司)，BCA蛋白定量试剂盒(武汉碧云天生物技术研究所)，AGEs(日本Biovision公司)，细胞钙离子测定试剂盒(上海杰美基因医药科技有限公司)，一抗RAGE、β-catenin、骨保护素(OPG，美国Cell Signaling公司)，二抗、上样缓冲液、一抗二抗稀释液(武汉碧云天生物技术研究所)，RAGE siRNA(广州锐博生物科技有限公司)。

    1.2 人股动脉平滑肌细胞培养与鉴定 2014年1月—2015年3月，取遗体捐献者股动脉(中山大学附属医院惠赠)，无菌环境下手术刀片刮除外膜和内膜,将中膜平滑肌层剪成1～2 mm组织块 ......