贺继刚，韩金秀，李贝贝，李宏远，李洪荣，严丹

    冠心病引起的心肌梗死(即心肌损伤)已成为目前世界范围内的头号“杀手”。目前国内外对心肌梗死的治疗主要分为外科冠状动脉旁路移植术、内科冠状动脉支架介入治疗及干细胞修复治疗。细胞治疗中应用最成熟的是骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，前期研究已经证明BMSCs可以修复心肌损伤[1]，但目前国内、外对干细胞疗效的报道仍不尽然[1]。GATA-4是调控心脏基因表达的重要转录因子，参与心脏正常发育、功能基因表达和心肌肥大的病理过程。本研究拟利用慢病毒携带GATA-4基因转染小鼠BMSCs，探讨过表达GATA-4-BMSCs修复心肌损伤的机制。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物 于2015年3月—2016年12月，选取60只健康4周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠，由成都达硕实验动物中心提供，动物许可证号为SCXK(川)2015-030。动物喂养、观察均按照药物非临床研究质量管理规范(GLP)规定执行。

    1.2 主要试剂和仪器 C57BL/6小鼠BMSCs培养基(低糖培养基，含10%胎牛血清)，购自美国Cyagen Biosciences公司。CD29、CD44、CD11b、干细胞抗原1(SCA-1)抗体购自美国BioLegend公司。CD11bMicroBeads购自美国Miltenyi公司。番茄凝集素购自美国Sigma公司。C-kit抗体购自美国eBioscience公司。PHILIPS EPIQ 7C心脏超声仪购自荷兰PHILIPS公司。荧光共聚焦显微镜购自日本Nikon公司。

    1.3 小鼠BMSCs分离、培养及鉴定 将小鼠脱颈处死，75%乙醇浸泡15 min，取出股骨和胫骨，再以75%乙醇浸泡Ⅰ～Ⅱ min，置于0.9%氯化钠溶液中，两端剪断暴露骨髓腔。1 ml注射器加0.9%氯化钠溶液冲出骨髓，收集至无菌离心管中，以1 500×g离心10 min，以含10%胎牛血清的C57BL/6小鼠BMSCs培养基重悬细胞制备细胞悬液，以2×106/cm2密度接种至25 cm2塑料培养瓶，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。并标记为原代。胰酶消化传代至第3代时采用CD11b磁珠负选，去除造血干祖细胞。继续传代至第7代，取生长至第7代的BMSCs，待细胞融合达80%～90%时，制备单细胞悬液，采用流式细胞检测CD29、CD44、CD11b、SCA-1(PE-CD29单抗 5 μl按 1∶20 稀释至 100 μl、PE/Cy5-CD445 μl按 1∶20 稀释至 100 μl、PE-CD11b单抗 5 μl按 1∶40 稀释至 100 μl、FITC anti-mouse SCA-1 5 μl按1∶20 稀释至 100 μl) ......