钱小英，林海锋，周安喜，卓曼云

    乳腺癌患者数量在全球范围内呈不断上升趋势，已成为临床重大难题之一[1]，其多发生于乳腺上皮组织，是一类恶性肿瘤。近年来，辅助诊断乳腺癌的启动子甲基化逐渐成为生物化学及医学界的研究重点和热点[2]。研究表明，多个癌基因及CpG位点的联合检测比单个癌基因更有利于诊断乳腺癌和揭示乳腺癌的临床分型和分子病理机制[3]。同时许多维持机体正常活动的DNA可能因乳腺癌启动子区CpG位点的甲基化而丧失其功能[4]。为加深对乳腺癌演变机制的认识，本研究将重点针对乳腺癌组织中胱甘肽S转移酶P1(GSTP1)、乳腺癌易感基因1(BRCA1)/O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)基因甲基化情况及其与临床病理特征的关系进行分析，以期为乳腺癌的发生发展以及临床诊治提供参考依据。

    1 对象与方法

    1.1 纳入与排除标准 纳入标准：(1)>18岁女性；(2)组织标本经过病理学检测后确诊为乳腺癌；(3)行乳腺癌切除术前接受放射治疗、化学药物治疗等；(4)知情同意并自愿参与本研究。排除标准：(1)伴有严重心、肝、肾功能不全或合并有其他高危疾病；(2)有神经系统疾病史、精神疾病史以及近期服用精神疾病药物；(3)有凝血功能障碍或其他手术禁忌证；(4)临床资料不全。

    1.2 研究对象 选取2015年1月—2016年6月海南医学院第二附属医院收治的符合纳入标准的乳腺癌患者100例为研究对象，年龄为24～75岁，平均年龄(43.6±9.8)岁。本研究获得本院伦理委员会批准。

    1.3 研究方法 乳腺癌切除术中取患者乳腺癌组织及其边缘5 cm处癌旁组织，分析患者乳腺癌组织临床病理特征，并立即放入温度为-196 ℃的液氮速冻箱中保存。

    1.3.1 DNA的提取及亚硫酸处理 通过组织DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)对患者乳腺癌组织中GSTP1、BRCA1、MGMT基因DNA进行提取，然后通过EZ DNA甲基化试剂盒-Gold(北京中西远大科技有限公司，型号BTT3-D5024)对200～500 ng DNA进行亚硫酸处理。试验操作均按照试剂盒说明书进行规范操作，操作过程保证无污染。

    1.3.2 甲基化特异性聚合酶链式反应(PCR)和电泳分析 加入1.5 μl经亚硫酸盐修饰的DNA模板、1.5 μl 10×缓冲液(含Mg2+)、0.12 μl Hotstar Taq DNA聚合酶、0.15 μl 20 nmol/L的下游引物、0.15 μl 20 nmol/L的上游引物、0.45 μl 20 mmol/L的dNTPs ......