王议鹤，王勤章，吴 双，申茂磊，褚 浩，钱 成，钱 彪*

    泌尿系结石是泌尿外科最常见的疾病之一[1]，该病的成因非常复杂，纳米细菌(nanobacteria，NB)感染被认为是结石形成的主要原因之一[2-3]，其在肾结石患者的血液、尿液和结石中的阳性检出率均在90%以上[4-5]。NB是一种具有超微结构的人体病原菌，具有较强的感染能力，能在菌体外周形成羟磷灰石结晶外壳，黏附并损害集合管上皮细胞及肾乳头细胞，从而形成结石[6]。

    随着医学技术的发展，结石诊疗有了长足的进步，但碎石治疗后患者的结石复发率仍然很高[7]。因此，探究泌尿系结石的形成机制以寻找新的治疗手段是当前临床中亟待解决的难题。四环素是为数不多的能在生理浓度下杀灭NB的抗菌药物之一，SHOSKES等[8]研究了四环素对NB相关慢性前列腺结石患者的治疗效果，其中80%患者的症状在治疗3个月后得到了极大改善，10例患者的结石缩小50%。然而，目前并不清楚NB如何在肾结石形成过程中发挥其独特作用。本课题旨在通过研究NB损伤人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)导致晶体滞留的机制以及四环素对这一过程的抑制作用，以期为泌尿系结石的预防和治疗提供新的思路。

    1 材料与方法

    1.1 主要试剂及仪器 HK-2细胞购自武汉大学保藏中心。DMEM培养基，1640培养基，胎牛血清，磷酸盐缓冲液(PBS)，HEPES缓冲液，一水草酸钙(COM)，纳米级羟基磷灰石(nHAP)，四环素，过氧化氢(H2O2)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒、Na+/K+ATP酶试剂盒、Ca2+/Mg2+ATP酶试剂盒，phalloidin-FITC。细胞孵育箱，倒置相差显微镜，透射电子显微镜，激光扫描共聚焦显微镜，酶标仪。

    1.2 NB培养与鉴定 于2016年10月—2017年10月在石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科收集临床确诊肾结石且未应用药物或手术治疗患者的尿液，将5～10 ml尿液采用0.9%氯化钠溶液稀释2倍，高速离心机4 ℃离心40 min(14 000×g)；取管底2 ml混匀，以0.45 μm滤器过滤，再经0.22 μm滤器加压过滤。将1 ml滤液注入含约4 ml DMEM培养液、10% γ-胎牛血清和1% HEPES缓冲液的细胞培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2培养箱培养。倒置相差显微镜观察NB生长，筛选出无污染的标本，用吸管吹打混匀后，吸入EP管。14 000×g，离心20 min，弃上清液，再加入无菌注射用水1.5 ml吹打混匀 ......