任广伟，龚淼，李明明，牛哲莉，杨洪娟，孙利军*

    氧糖剥夺/复氧(OGD/R)细胞模型多被用于在细胞水平上模拟急性缺血-再灌注(I/R)损伤的过程，应用此模型可进行药物保护作用与机制的研究和治疗靶向的探讨[1]。肾I/R 是导致急性肾损伤的常见原因[2]，研究发现，肾I/R 损伤引起肾小管上皮细胞死亡的主要方式是坏死与铁死亡，其主要机制是细胞脂质过氧化[3-5]。普罗布考是具有很强抗氧化作用的降血脂药[6]，多项研究表明，普罗布考可以通过提高细胞内抗氧化酶活性降低脂质过氧化水平，具有较好的组织或细胞保护作用[7]。目前，尚未见到关于普罗布考对OGD/R 引起的人肾小管上皮细胞株(HK-2)损伤影响的报道。为此，本研究通过建立HK-2 的OGD/R 模型模拟肾小管上皮细胞的I/R 损伤，研究普罗布考对HK-2 损伤的保护作用及机制，以期为寻找新的治疗方向提供实验基础。

    1 材料与方法

    1.1 实验时间 本实验时间为2017年12月—2018年9月。

    1.2 细胞株与主要试剂 HK-2(中国科学院上海生科院细胞资源中心)，普罗布考、凋亡抑制剂(Z-VADFMK)、铁死亡抑制剂(Fer-1)、坏死性凋亡抑制剂、自噬抑制剂(3-methyladenine)、丙二醛(MDA)检测试剂盒、谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性检测试剂盒(Sigma 公司)，兔抗GPX4 单克隆抗体(sc-166120)、兔抗β-actin 单克隆抗体(sc-58673)(Santa Cruz 公司)，噻唑蓝(MTT)细胞增殖活性检测试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测分析试剂盒和ECL 化学发光试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。

    1.3 OGD/R 模型的建立方法 参照WEI 等[1]的方法常规培养HK-2 至完全贴壁，用缺血模拟溶液(包括5.37 mmol/L KCl、136.89 mmol/L NaCl、0.44 mmol/L KH2PO4、0.338 mmol/L Na2HPO4、4.166 mmol/L NaHCO3和5 mmol/L D-葡萄糖，pH 值为6.8)代替常规培养液培养细胞，将细胞放入含5% CO2和95% N2的密闭容器，将密闭容器放入缺氧培养箱(5% CO2、1% O2和94% N2)于37 ℃培养2 h 模拟缺血缺氧条件，2 h 后用常规培养液替换缺血模拟溶液在37 ℃、5% CO2正常条件下培养3 h 模拟复氧过程。

    1.4 预实验确定普罗布考最佳作用时间与浓度 取HK-2 ......