司超 ，张治平 ，范志茹 ，张亮 ，李丽 ，司军强 ，李新芝 ，马克涛 *

    老年性耳聋是指随着年龄的增长而缓慢出现听力阈值增加的疾病[1-3]。耳蜗螺旋动脉(SMA)是供应耳蜗血液循环系统的唯一动脉[4]。研究发现，耳蜗血流量减少、机体缺氧和炎性反应，与老年性耳聋的听力损伤关系密切[5]。SMA上相邻的细胞间存在大量的缝隙连接通道，细胞间的通讯依赖于缝隙连接[6-7]，连接蛋白(Cx)是构成缝隙连接的基本单位，在血管壁上Cx43的表达尤为丰富[8-9]。AAP10为缝隙连接的激动剂，可以增强缝隙连接的功能及表达。研究证明，耳蜗外侧壁螺旋韧带上Cx26、Cx30表达下调可导致耳蜗内电位减少和听力损失[10]，而SMA上Cx43随年龄变化的特点尚不清楚。因此，本实验通过研究D-半乳糖(D-gal)致豚鼠和原代平滑肌细胞衰老情况下SMA上Cx43的表达变化，探讨Cx43在老年性耳聋中可能发挥的作用。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物及研究时间 无耳疾3月龄SPF级豚鼠36只，雌雄不拘，购自新疆医科大学动物实验中心，动物使用许可证批号：CXK New(2003-0001)。所有豚鼠低噪音环境下常规饲养，温度20 ℃，湿度45 %。饲养及实验过程严格按照《石河子大学医学伦理委员会条例》进行。研究时间为2018年5月。

    1.2 主要试剂及仪器 D-gal、牛血清白蛋白(BSA)(美国Sigma公司)；超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；DMED/F-12培养基、胎牛血清(FBS)(美国Hyclone公司)；DAPI溶液(北京索莱宝科技有限公司)；小鼠单克隆Cx43抗体、平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin)抗体(美国Abcam公司)；Connexin 43 FITC标记二抗(北京联科生物公司)；AAP10(杭州中肽生化有限公司)、RNeasy Mini Kit试剂盒(德国 QIAGEN 公司)；β-actin一抗、二抗(北京中杉金桥公司)；激光共聚焦显微镜(LSM510，德国Carl Zeiss公司)、CFX96Touch荧光定量PCR检测系统(Bio-Rad美国)。

    1.3 实验方法

    1.3.1 豚鼠衰老模型的制备 将豚鼠随机分为Control组、NS组及D-gal组，每组12只。D-gal组在正常饲养的基础上，颈背部皮下注射D-gal 500 mg·kg-1·d-1；NS组在正常饲养的基础上，颈背部皮下注射0.9%氯化钠溶液(体积等同D-gal组)；Control组正常饲养 ......