朱小波，马发鑫，冯琳，郑跃，沙卫红，陈浩

    新生儿坏死性小肠结肠炎(NEC)是新生儿，特别是早产儿最为常见的消化系统急危重症，其病死率可高达30%，严重地危害了患儿生命[1-2]。NEC的发病机制尚未明确，一般文献报道有以下几种危险因素：(1)肠上皮细胞的缺血缺氧性损伤；(2)肠道发育不成熟；(3)肠道微生物群的异常定植；(4)配方奶喂养等[2-5]。病理特征主要以回肠末端的损害最为严重，并且病情发展快，目前临床无有效的治疗措施，存活者中仍有约半数存留营养不良、肠狭窄、短肠综合征等后遗症[6-7]。故当前亟需针对其发病机制寻找更有效的防治方法。

    间充质干细胞(MSCs)是一类在特定条件下具有多向分化潜能的干细胞，其对组织损伤的修复作用已在心脏、肝脏、肺及小肠等器官被证实。除此之外，MSCs还具有强大的免疫调节和抗炎能力，可调控放射性小肠炎、炎症性肠病、骨髓移植等疾病的炎性反应[8-11]。近年研究表明，在NEC发病过程中，Toll样

    受体炎症信号通路被激活，从而启动炎症级联反应，诱发多种促炎因子包括白介素(IL)-1β、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的升高，参与肠道损伤和炎性反应；而过量上皮细胞的凋亡和炎性因子的释放可能造成肠道局部缺血坏死，进而导致消化道炎症的发生，加重NEC的病情[12-13]。本课题组前期研究发现不同状态间充质干细胞条件培养基(MSC-CM)能下调多种小肠损伤炎性反应，对肠道起到保护作用[14]，但对NEC炎性反应的作用和机制尚未明确，故本研究旨在探讨炎症激活前后不同状态MSC-CM对NEC炎性反应调控作用的差异及其机制，为探索NEC新的治疗手段提供理论基础和实验依据。

    1 材料与方法

    1.1 实验时间与地点 2018年7月—2019年4月，在广东省人民医院(广东省医学科学院)中心实验室、中山大学中心实验室、华南理工实验动物中心完成本实验。

    1.2 实验动物 清洁级新生Sprague-Dawley(SD)孕鼠，用于获得早产新生大鼠，早产新生大鼠雌雄不限，用于建立NEC模型。雌性SD大鼠，3～4周龄，体质量60～80 g，SPF级，用于获取骨髓MSCs。均由中山大学北校区实验中心、华南理工实验动物中心提供，所有动物经检疫符合实验动物标准，实验方法符合医学伦理学要求。

    1.3 实验试剂与材料 Similac配方奶粉(美国Abbott公司)；保育箱和缺氧箱(中山大学北校区实验中心)；DMEM-F12培养基(美国Hycolne公司)；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国R&D公司)；胎牛血清(美国Hycolne公司)；TrypLEExpress胰酶代替物(美国Invirogen公司)；抗大鼠CD29-FITC、CD34-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC单克隆抗体(美国Biolegend公司)；CD4和Foxp3单克隆抗体(美国eBiosciences公司) ......