表达hCD4和hCCR5基因的慢病毒载体的构建(2)
1.2.4基于293T细胞的慢病毒包装 在5ml离心管先加入1-5 ml无血清Opti-MEMI培养液，再加入pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4、pLV/helper-SL5、目的质粒(各4μg)，轻轻颠倒混匀；另取1支无菌的5 ml离心管，加入1.5ml无血清Opti-MEMI培养液和40μl的Lipofeetamine 2000，轻轻颠倒混匀。室温孵育5min；将已稀释DNA加入到含有Lipofeetamine 2000的无血清Opti-MEM I培养液中，轻轻颠倒混匀。室温孵育20min，制备获得DNA-Lipofeetamine 2000复合物。将复合物添加到293FT细胞中过夜培养，转染后24h，更换10 ml含10%血清DMEM培养液。转染后48 h、72 h收集培养上清进行浓缩，分装好的病毒放置80℃保存。1.2.5 293T细胞中mRNA的qRT-PCR检测 取对数生长期的293T细胞，置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、5%CO2的培养箱中培养。当细胞融合率达50%左右，加入慢病毒载体，传代培养。7 d后收集细胞用Trizol法提取总RNA，参照潞蜕明书进行逆转录合成cDNA，以逆转录所得到的cDNA为模板进行RT-PCR。引物序列为：CD4(上游引物：5’-TGCCTCAGTATGCTGGCTCT-3’ ......
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