新型多孔双相磷酸钙支架与兔骨髓间充质干细胞相容性的体外实验研究(2)
才逐渐出现上述变化。
3.2 支架材料上细胞的电镜下观察：细胞接种后第2天，支架孔隙表面细胞吸附。细胞多为扁圆形及不规则形。表面光滑，单层离散分布。材料表面暴露较多。实验组吸附细胞较对照组均匀，密集，第7天，细胞逐渐伸展，形态变为多角形。细胞表面高密度圆形颗粒增多。细胞和材料表面结合更加紧密，并逐渐由原位向周围增殖，爬行。细胞间接触增多。支架孔隙结构存在，材料暴露面减小，实验组更为明显，第14天，实验组细胞形态多为长扁梭形，胞质而积较大，叠层覆盖材料面。支架孔隙结构存在，几乎无材料面暴露，大量索条状胶原和细胞胶着分布，表面可见较多大小不等的球形高密度颗粒，经能谱分析为钙盐结晶。而对照组细胞形态较实验组短小，分布不均，支架部分区域仍然裸露。但细胞覆盖区域也有胶原及钙盐结晶胶着分布。
3.3 MTT检测结果：如表1所示，各组MTT光密度值随培养时间的延长而增大。培养各时段，实验组均高于其它两组，差别有统计学意义(P<0.01)。对照组在第6天和第10天均低于空白对照组，差别有统计学意义(P<0.01)，而第2天和第14天，差别无统计学意义。
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3.4 ALP检测结果：如表2所示，各组ALP检测值随培养时间的延长逐渐增大。各时间段，实验组均高于其它两组，差别有统计学意义(p<0.01)。对照组在第2天和第6天低于空白对照组，但第10天和14天高于空白对照组，差别均有统计学意义。
4 讨论
优良的骨组织工程支架应具备：良好的生物相容性；适宜的生物降解性；三维立体多孔结构；可塑性和有一定的机械强度；良好骨传导性和骨诱导性。完全符合上述条件的材料尚未开发出。而生物材料的表面特性如颗粒直径、颗粒之间的孔径是影响成骨细胞存活，增殖等生理功能的主要决定因素。本实验采用的支架是在BCP支架孔隙表面复合纳米羟基磷灰石涂层，综合了两种材料的特点。新合成支架的平均孔径、孔隙率、孔隙问的相互贯通均可满足支架内营养物质的交换及细胞的长入，符合既往研究成果。
目前用于构建工程骨的种子细胞主要有骨膜来源成骨细胞和骨髓间充质干细胞。BMSCs的巨大优势在于；易于获取；体外可短期大量扩增；其自身部分亚群具有较强的成骨倾向，部分亚群在适当的诱导条件下更易向成骨分化；大量获取时不易造成供区部位的创伤。
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相对于传统的以体内植入实验，体外实验快速，方法标准化，条件可控，因此具有可操作性和可比性。这使得在过去的二十年中，体外实验被广泛的应用于材料的生物相容性评价。本次实验按照经典工程组织体外构建的程序，采用二次沉淀法接种种子细胞。此外细胞接种密度会影响其增殖与分化，Haynesworth等认为细胞初始接种密度在(0.7～20)×106/ml较为合适，本次实验根据自身特点选择接种密度为1.25×106/ml。
扫描电镜结果显示培养早期细胞在两组材料孔隙内外表面均能较好吸附，实验组吸附细胞密度更大，更均匀。考虑为纳米羟基磷灰石比表面积大导致更多培养液大分子蛋白质吸附及早期电离产生的离子界面均有利于细胞的吸附及均匀分布。Webster的实验结果与本实验相符。随着培养时间延长，实验组细胞较对照组更加伸展，胞质更加均匀覆盖材料，且细胞外胶原及钙盐沉积也更加密集。光镜下所见也与之符合。说明在成骨诱导环境中，BMSCs逐渐向目的细胞一成骨细胞分化，并体现其分泌骨基质，促进成骨的功能。在一定范围内，密集而均匀的早期细胞吸附有利于细胞间的相互作用，使得细胞群体的增殖、分化功能加强。低结晶度纳米羟基磷灰石的早期降解使得材料表面更早形成的类骨磷灰石可促进胶原和矿物的沉积。
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骨组织工程支架材料应该支持BMSC在其中快速增殖及成骨分化。MTT法检测细胞的增殖活性已被广泛应用。ALP是骨组织形成、代谢、再生过程中的重要矿化酶，同时又是细胞分化成熟和具有成骨能力的重要标志酶，是BMSCs向骨化亚群细胞分化和向骨组织转化的前提。实验结果显示实验组细胞的增殖及分化功能在各时段均高于对照组和空白对照组：而对照组在早期均低于空白对照组，中期后逐渐恢复，至培养末期增殖功能与空白对照组无显著差别，分化功能高于窄白对照组。此现象说明两组材料对BMSCs无明显细胞毒性作用，而且可以促进BMSCs向成骨细胞分化。相对于空白对照组，对照组细胞需要较长的适应期才能恢复细胞的功能，至培养晚期，其增殖与分化功能才达到甚至超过单纯培养细胞的水平。原因可能是材料早期降解，使细胞周围环境PH值产生较大的波动，细胞的功能受到暂时抑制。随着材料降解趋于平稳，环境变化幅度减小，加上定期更换培养液，使得细胞的功能逐渐恢复。然而实验组材料没有出现早期细胞功能抑制，且在培养各时段其功能均高于其它两组，主要原因可能是纳米羟基磷灰石快速降解导致细胞周围钙、磷离子浓度升高特别是钙离子浓度的升高通过某种信号转导机制使早期细胞功能得以维持，更有利于细胞的增殖与分化。同时纳米层降解后在孔隙表面形成的类骨磷灰石层也有利于吸附细胞的增殖与分化。这些因素的作用可能抵消了微环境PH值改变对细胞早期功能的抑制。各时期扫描电镜所见也验证了功能实验的结果。
BCP复合纳米羟基磷灰石支架与兔BMSCs在体外具有良好的相容性。接种于该支架内的BMSCs较基体支架具有更高的增殖及分化能力。该支架值得进一步进行动物体内植入实验。
编辑 张惠娟
通讯作者：章庆国，教授，主任医师，硕士研究生导师；中国医学科学院整形外科医院耳再造中心二科主任，北京100096；主要研究方向：整形外科临床及相关基础研究：E-mail：plasticl35@126.com
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3.2 支架材料上细胞的电镜下观察：细胞接种后第2天，支架孔隙表面细胞吸附。细胞多为扁圆形及不规则形。表面光滑，单层离散分布。材料表面暴露较多。实验组吸附细胞较对照组均匀，密集，第7天，细胞逐渐伸展，形态变为多角形。细胞表面高密度圆形颗粒增多。细胞和材料表面结合更加紧密，并逐渐由原位向周围增殖，爬行。细胞间接触增多。支架孔隙结构存在，材料暴露面减小，实验组更为明显，第14天，实验组细胞形态多为长扁梭形，胞质而积较大，叠层覆盖材料面。支架孔隙结构存在，几乎无材料面暴露，大量索条状胶原和细胞胶着分布，表面可见较多大小不等的球形高密度颗粒，经能谱分析为钙盐结晶。而对照组细胞形态较实验组短小，分布不均，支架部分区域仍然裸露。但细胞覆盖区域也有胶原及钙盐结晶胶着分布。
3.3 MTT检测结果：如表1所示，各组MTT光密度值随培养时间的延长而增大。培养各时段，实验组均高于其它两组，差别有统计学意义(P<0.01)。对照组在第6天和第10天均低于空白对照组，差别有统计学意义(P<0.01)，而第2天和第14天，差别无统计学意义。
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3.4 ALP检测结果：如表2所示，各组ALP检测值随培养时间的延长逐渐增大。各时间段，实验组均高于其它两组，差别有统计学意义(p<0.01)。对照组在第2天和第6天低于空白对照组，但第10天和14天高于空白对照组，差别均有统计学意义。
4 讨论
优良的骨组织工程支架应具备：良好的生物相容性；适宜的生物降解性；三维立体多孔结构；可塑性和有一定的机械强度；良好骨传导性和骨诱导性。完全符合上述条件的材料尚未开发出。而生物材料的表面特性如颗粒直径、颗粒之间的孔径是影响成骨细胞存活，增殖等生理功能的主要决定因素。本实验采用的支架是在BCP支架孔隙表面复合纳米羟基磷灰石涂层，综合了两种材料的特点。新合成支架的平均孔径、孔隙率、孔隙问的相互贯通均可满足支架内营养物质的交换及细胞的长入，符合既往研究成果。
目前用于构建工程骨的种子细胞主要有骨膜来源成骨细胞和骨髓间充质干细胞。BMSCs的巨大优势在于；易于获取；体外可短期大量扩增；其自身部分亚群具有较强的成骨倾向，部分亚群在适当的诱导条件下更易向成骨分化；大量获取时不易造成供区部位的创伤。
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相对于传统的以体内植入实验，体外实验快速，方法标准化，条件可控，因此具有可操作性和可比性。这使得在过去的二十年中，体外实验被广泛的应用于材料的生物相容性评价。本次实验按照经典工程组织体外构建的程序，采用二次沉淀法接种种子细胞。此外细胞接种密度会影响其增殖与分化，Haynesworth等认为细胞初始接种密度在(0.7～20)×106/ml较为合适，本次实验根据自身特点选择接种密度为1.25×106/ml。
扫描电镜结果显示培养早期细胞在两组材料孔隙内外表面均能较好吸附，实验组吸附细胞密度更大，更均匀。考虑为纳米羟基磷灰石比表面积大导致更多培养液大分子蛋白质吸附及早期电离产生的离子界面均有利于细胞的吸附及均匀分布。Webster的实验结果与本实验相符。随着培养时间延长，实验组细胞较对照组更加伸展，胞质更加均匀覆盖材料，且细胞外胶原及钙盐沉积也更加密集。光镜下所见也与之符合。说明在成骨诱导环境中，BMSCs逐渐向目的细胞一成骨细胞分化，并体现其分泌骨基质，促进成骨的功能。在一定范围内，密集而均匀的早期细胞吸附有利于细胞间的相互作用，使得细胞群体的增殖、分化功能加强。低结晶度纳米羟基磷灰石的早期降解使得材料表面更早形成的类骨磷灰石可促进胶原和矿物的沉积。
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骨组织工程支架材料应该支持BMSC在其中快速增殖及成骨分化。MTT法检测细胞的增殖活性已被广泛应用。ALP是骨组织形成、代谢、再生过程中的重要矿化酶，同时又是细胞分化成熟和具有成骨能力的重要标志酶，是BMSCs向骨化亚群细胞分化和向骨组织转化的前提。实验结果显示实验组细胞的增殖及分化功能在各时段均高于对照组和空白对照组：而对照组在早期均低于空白对照组，中期后逐渐恢复，至培养末期增殖功能与空白对照组无显著差别，分化功能高于窄白对照组。此现象说明两组材料对BMSCs无明显细胞毒性作用，而且可以促进BMSCs向成骨细胞分化。相对于空白对照组，对照组细胞需要较长的适应期才能恢复细胞的功能，至培养晚期，其增殖与分化功能才达到甚至超过单纯培养细胞的水平。原因可能是材料早期降解，使细胞周围环境PH值产生较大的波动，细胞的功能受到暂时抑制。随着材料降解趋于平稳，环境变化幅度减小，加上定期更换培养液，使得细胞的功能逐渐恢复。然而实验组材料没有出现早期细胞功能抑制，且在培养各时段其功能均高于其它两组，主要原因可能是纳米羟基磷灰石快速降解导致细胞周围钙、磷离子浓度升高特别是钙离子浓度的升高通过某种信号转导机制使早期细胞功能得以维持，更有利于细胞的增殖与分化。同时纳米层降解后在孔隙表面形成的类骨磷灰石层也有利于吸附细胞的增殖与分化。这些因素的作用可能抵消了微环境PH值改变对细胞早期功能的抑制。各时期扫描电镜所见也验证了功能实验的结果。
BCP复合纳米羟基磷灰石支架与兔BMSCs在体外具有良好的相容性。接种于该支架内的BMSCs较基体支架具有更高的增殖及分化能力。该支架值得进一步进行动物体内植入实验。
编辑 张惠娟
通讯作者：章庆国，教授，主任医师，硕士研究生导师；中国医学科学院整形外科医院耳再造中心二科主任，北京100096；主要研究方向：整形外科临床及相关基础研究：E-mail：plasticl35@126.com
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