人表皮干细胞的体外分离培养和鉴定(2)
1.6 细胞鉴定
1.6.1 细胞克隆形成率测定:细胞克隆形成率测定:取第2 代表皮干细胞及角质细胞,制备单细胞悬液,按200个细胞/孔接种于6 孔培养板。培养2周后对细胞进行克隆计数并计算克隆形成率(CFE),其公式为CFE=细胞克隆数/接种细胞数×100%。以角质细胞作对照。
1.6.2 细胞表面标志物的鉴定:免疫细胞化学染色:取原代细胞爬片,PBS冲洗3次,4%多聚甲醛室温固定30min,二步免疫组化检测法分别行细胞K19和β1整合素免疫细胞化学染色;同时用PBS代替一抗作空白对照。
1.6.3 统计学处理:数据以x±s表示,采用SPSS10.0统计软件行t检验。
2结果
2.1 培养细胞的生物学特性:筛选后贴壁的表皮干细胞于倒置相差显微镜下观察,细胞均匀分散,呈圆形,胞体小,折光性强;24h后细胞略伸展为扁平的三角形或多边形;3天后,有部分细胞形成较小克隆,包体紧密相靠,包膜互相衔接,呈典型“铺路石样”生长,继续培养,克隆逐渐扩大部分中央会出现细胞复层生长(图1~3)。
2.2 表皮干细胞的克隆形成率:表皮干细胞与角质形成合细胞相比,增殖速度相对较慢,但所形成的克隆大于后者。原代表皮干细胞融合时间约14~18天,同代角质细胞在8~10天即可融合 ......
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