去铁胺促进血管内皮祖细胞靶向归巢和血管化的实验研究(4)
2.3.2 外源性EPCs在缺血下肢的分化以及CXCR4的表达：免疫荧光染色观察到移植的外源性EPCs分化成血管内皮细胞参与了组织的修复。进一步观察术后14d组织切片CXCR4的表达，EPCs-DFO的CXCR4表达明显高于其他组，该作用被LY294002所抑制。这些结果表明DFO促进EPCs向损伤处的迁移，通过自身分化促进血管生成。见图5。
2.4 Western Blot检测组织中细胞因子：在DFO的刺激下观察缺血组织中各种蛋白的表达，EPCs-DFO组HIF-1α较其他组表达更高，其下游的p-AKT，VEGF，SDF-1和p-eNOS也出现高表达，EPCs组和EPCs-DFO-AMD组蛋白的表达情况相似，高于对照组，LY294002抑制这些蛋白的表达。结果表明DFO刺激促血管生成因子的表达，这种作用被PI3K抑制劑LY294002所抑制。见图6。
3 讨论
EPCs在血管化过程中起重要作用，尤其在缺血环境中。EPCs移植发挥作用主要通过EPCs向缺血或创伤组织迁徙，分泌一类促进血管新生的因子和直接分化为血管内皮细胞参与新的血管生成而发挥治疗作用[11-12]。因此，EPCs向缺血或创伤部位的靶向归巢是其发挥作用的重要前提。
, 百拇医药
目前干细胞归巢的机制仍不能完全明确，主要的分子机制包括：SDF-1/CXCR4信号轴、HGF/c-met信号轴、MCP-3/CCR1、3、5信号轴以及黏附因子等[13]，其中SDF-1/CXCR4信号轴通路是目前研究最多的一种机制。SDF-1被认为是重要的趋化因子，招募干细胞向损伤处迁移。SDF-1/CXCR4的激活可以上调EPCs向缺血损伤处的迁移，进一步促进血管化[14]，可以通过提高靶组织SDF-1的含量和/或上调CXCR4的表达[15]，来促进干细胞归巢。研究表明缺氧环境可以通过激活SDF-1，增加EPCs的迁移，刺激缺血组织血管化[3]。DFO通过稳定HIF-1α蛋白模拟缺氧环境，激活SDF-1及下游基因表达[16]。因此DFO可能成为一种新的方法促进EPCs归巢。
在本实验中，笔者证实了DFO的应用显著减少了下肢坏死的几率，改善了缺血下肢的血流灌注情况，增加了缺血组织的毛细血管密度和动脉密度，结果证明了DFO可以促进缺血下肢再血管化。通过移植带有荧光素酶报告基因的EPCs，应用生物发光成像技术动态观察细胞的迁移，发现移植的外源性EPCs向损伤处迁移。在移植早期，细胞主要分布在肺内及向损伤处聚集。术后14d，DFO组缺血下肢的光子信号强度明显高于其他组，表明较多的EPCs聚集于此，结果证明DFO的应用促进了EPCs向损伤缺血组织的靶向归巢。通过免疫荧光染色观察到移植的外源性EPCs分化成血管内皮细胞，参与了组织的修复，并且DFO组的CXCR4表达明显高于其他组。通过WB检测发现DFO组的各种促血管生成因子的表达高于其他组。因此，应用DFO是一种有效地促进EPCs向损伤处迁移、靶向归巢的策略。
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在多种类型的细胞研究中发现 PI3K/AKT信号转导通路在细胞增殖、迁移和存活方面中起重要作用。Zheng[17]报道PI3K/AKT/eNOS信号转导通路在SDF-1诱导的EPCs迁移中起调控作用，Jiang[18]报道PI3K信号可以调控VEGF的表达，Dimmeler[19]报道PI3K信号在血管化过程中激活eNOS。因此，PI3K/AKT通路可能与血管化过程相关。在本实验中，DFO促进血管化和EPCs靶向归巢的作用以及促进SDF-1、CXCR4、p-AKT、p-eNOS高表达的作用均能够被PI3K/AKT抑制剂LY294002和CXCR4拮抗剂AMD3100所废除或部分抑制。AMD3100虽然是CXCR4受体的拮抗剂，但是被证明可以促进血管新生过程，抑制血管生成过程[20]，本文的实验结果与文献报道相符。LY294002作为PI3K抑制剂，能够废除DFO促进EPCs靶向归巢和血管新生的作用，表明DFO对EPCs迁移的影响与PI3K/AKT信号转导通路相关，实验结果与Peyvandi[21]的报道相符。
总之，DFO作为低氧模拟剂，是用于治疗缺血性疾病的一种有潜力的药物，其作用机制是通过稳定HIF-1α的表达，模拟低氧环境，激活PI3K/AKT信号通路，上调下游SDF-1、VEGF等因子的表达，促进EPCs的归巢，提高缺血组织血管化，改善缺血组织血流灌注。
, 百拇医药
[参考文献]
[1]Jiang M，Wang B，Wang C，et al.Angiogenesis by transplantation of HIF-1 alpha modified EPCs into ischemic limbs[J].J Cell Biochem，2008，103(1)：321-334.
[2]Schachinger V，Erbs S，Elsasser A，et al.Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction[J].N Engl J Med，2006，355(12)：1210-1221.
[3]Ceradini DJ，Kulkarni AR，Callaghan MJ，et al.Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients through HIF-1 induction of SDF-1[J].Nat Med，2004，10(8)：858-864.
[4]Bergeron M，Yu AY，Solway KE，et al.Induction of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) and its target genes following focal ischaemia in rat, 百拇医药(郑胜武 黄雄梅 庄兢 林根辉 杨宇 丁昕)
2.4 Western Blot检测组织中细胞因子：在DFO的刺激下观察缺血组织中各种蛋白的表达，EPCs-DFO组HIF-1α较其他组表达更高，其下游的p-AKT，VEGF，SDF-1和p-eNOS也出现高表达，EPCs组和EPCs-DFO-AMD组蛋白的表达情况相似，高于对照组，LY294002抑制这些蛋白的表达。结果表明DFO刺激促血管生成因子的表达，这种作用被PI3K抑制劑LY294002所抑制。见图6。
3 讨论
EPCs在血管化过程中起重要作用，尤其在缺血环境中。EPCs移植发挥作用主要通过EPCs向缺血或创伤组织迁徙，分泌一类促进血管新生的因子和直接分化为血管内皮细胞参与新的血管生成而发挥治疗作用[11-12]。因此，EPCs向缺血或创伤部位的靶向归巢是其发挥作用的重要前提。
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目前干细胞归巢的机制仍不能完全明确，主要的分子机制包括：SDF-1/CXCR4信号轴、HGF/c-met信号轴、MCP-3/CCR1、3、5信号轴以及黏附因子等[13]，其中SDF-1/CXCR4信号轴通路是目前研究最多的一种机制。SDF-1被认为是重要的趋化因子，招募干细胞向损伤处迁移。SDF-1/CXCR4的激活可以上调EPCs向缺血损伤处的迁移，进一步促进血管化[14]，可以通过提高靶组织SDF-1的含量和/或上调CXCR4的表达[15]，来促进干细胞归巢。研究表明缺氧环境可以通过激活SDF-1，增加EPCs的迁移，刺激缺血组织血管化[3]。DFO通过稳定HIF-1α蛋白模拟缺氧环境，激活SDF-1及下游基因表达[16]。因此DFO可能成为一种新的方法促进EPCs归巢。
在本实验中，笔者证实了DFO的应用显著减少了下肢坏死的几率，改善了缺血下肢的血流灌注情况，增加了缺血组织的毛细血管密度和动脉密度，结果证明了DFO可以促进缺血下肢再血管化。通过移植带有荧光素酶报告基因的EPCs，应用生物发光成像技术动态观察细胞的迁移，发现移植的外源性EPCs向损伤处迁移。在移植早期，细胞主要分布在肺内及向损伤处聚集。术后14d，DFO组缺血下肢的光子信号强度明显高于其他组，表明较多的EPCs聚集于此，结果证明DFO的应用促进了EPCs向损伤缺血组织的靶向归巢。通过免疫荧光染色观察到移植的外源性EPCs分化成血管内皮细胞，参与了组织的修复，并且DFO组的CXCR4表达明显高于其他组。通过WB检测发现DFO组的各种促血管生成因子的表达高于其他组。因此，应用DFO是一种有效地促进EPCs向损伤处迁移、靶向归巢的策略。
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在多种类型的细胞研究中发现 PI3K/AKT信号转导通路在细胞增殖、迁移和存活方面中起重要作用。Zheng[17]报道PI3K/AKT/eNOS信号转导通路在SDF-1诱导的EPCs迁移中起调控作用，Jiang[18]报道PI3K信号可以调控VEGF的表达，Dimmeler[19]报道PI3K信号在血管化过程中激活eNOS。因此，PI3K/AKT通路可能与血管化过程相关。在本实验中，DFO促进血管化和EPCs靶向归巢的作用以及促进SDF-1、CXCR4、p-AKT、p-eNOS高表达的作用均能够被PI3K/AKT抑制剂LY294002和CXCR4拮抗剂AMD3100所废除或部分抑制。AMD3100虽然是CXCR4受体的拮抗剂，但是被证明可以促进血管新生过程，抑制血管生成过程[20]，本文的实验结果与文献报道相符。LY294002作为PI3K抑制剂，能够废除DFO促进EPCs靶向归巢和血管新生的作用，表明DFO对EPCs迁移的影响与PI3K/AKT信号转导通路相关，实验结果与Peyvandi[21]的报道相符。
总之，DFO作为低氧模拟剂，是用于治疗缺血性疾病的一种有潜力的药物，其作用机制是通过稳定HIF-1α的表达，模拟低氧环境，激活PI3K/AKT信号通路，上调下游SDF-1、VEGF等因子的表达，促进EPCs的归巢，提高缺血组织血管化，改善缺血组织血流灌注。
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[参考文献]
[1]Jiang M，Wang B，Wang C，et al.Angiogenesis by transplantation of HIF-1 alpha modified EPCs into ischemic limbs[J].J Cell Biochem，2008，103(1)：321-334.
[2]Schachinger V，Erbs S，Elsasser A，et al.Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction[J].N Engl J Med，2006，355(12)：1210-1221.
[3]Ceradini DJ，Kulkarni AR，Callaghan MJ，et al.Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients through HIF-1 induction of SDF-1[J].Nat Med，2004，10(8)：858-864.
[4]Bergeron M，Yu AY，Solway KE，et al.Induction of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) and its target genes following focal ischaemia in rat, 百拇医药(郑胜武 黄雄梅 庄兢 林根辉 杨宇 丁昕)