不同分离方法及培养条件对人脐带间充质干细胞生物活性的影响
1.2.1.2 胶原酶消化法:开始同组织块贴壁法,脐带剪碎至碎泥状转移至1g/L胶原酶Ⅱ中,37℃恒温振荡仪持续消化30min后,随即用1g/L胰酶37℃恒温振荡仪持续消化30min。以细胞筛过滤消化液,滤液1 500r/min离心10min,弃上清液以PBS洗2次。按照1.0×106/cm2的密度均匀接种于含DMEM-F12培养液(含10% FBS)的培养皿中。3d后首次换液,去掉未贴壁细胞。以后每2d换液1次,至贴壁细胞80%融合后传代。1.2.2 细胞消化传代:弃去培养基,10% PBS冲洗3遍,加入胰蛋白酶(2.5g/L)和EDTA(0.2g/L)混合液(1:1)消化后可见细胞收缩变圆,即将脱离皿壁时弃消化酶,加2倍体积10% PBS终止消化,反复吹打混匀,1 000r/min离心10min弃上清液,加入新鲜培养基,以1:3~1:4比例细胞传代,记P1,传至P3代后, 细胞形态较为单一稳定。每日用倒置相差显微镜观察细胞的活力和生长情况,并适时照相。
1.2.3 流式细胞仪鉴定:取P3、P5、P7代hUCMSCs,弃培养基,1:1的2.5g/L胰蛋白酶(2.5g/L)和EDTA(0.2g/L)混合液(1:1)消化 ......
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