β1整合素在鼠切牙颈环上皮细胞中的表达(1)
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2010年2月1日
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【摘要】目的: 观察β1整合素在鼠切牙颈环上皮细胞中的表达情况及意义。方法:体外分离、培养和纯化鼠切牙颈环上皮细胞,以β1整合素多克隆抗体为一抗,进行免疫组织化学染色。结果:颈环上皮细胞呈多角形,克隆状生长,免疫组织化学染色发现β1整合素在鼠切牙颈环上皮细胞中呈阳性表达。结论:鼠切牙颈环上皮细胞中富含干细胞,β1整合素可作为颈环上皮干细胞的标记物。
【关键词】颈环;上皮细胞;细胞培养;β1整合素
【中图分类号】R392.3 【文献标识码】B 【文章编号】1008-6455(2010)08-0119-02
The expression of integrin-β1 in cervical-loop epithelial cellsof Wistar rat lower incisors
Xie Longchuan Hu Xiaoli Zhang Wenfeng Leng Weidong Luo Zhixiao
【Abstract】Objective:To observe the expression of β1-integrin in cervical-loop epithelial cells in Wistar rat lower incisorsand its meaning.Methods:The cervical-loop tissues were cultured in viro and purified.The purified cells were then identified by immunohistochemi-stry staining.Results:The cervical-loop epithelial cells are poly-angle and clone formation.The cervical-loop epithelial cells exhibit positive expression for integrin-β1 in immunohistochemistry staining.Conclusion:The cervical-loop epithelial cells are riching in stem cells in rat lower incisors.Integrin-β1 can be a marker of tooth epithelial stem cells.
【Key words】cervical-loop;epithelial cell;cell culture;integrin-β1
整合素β1(β1-integfin)主要使干细胞与其周围的细胞外基质黏附维持其自身的稳定性。它与其配体相互作用可以为干细胞的分化、增殖提供适当的微环境并控制干细胞的增殖和分化,因此它是上皮干细胞研究常用的标记物之一。上皮干细胞具有通过整合素(integrin)与基膜黏附的特性,整合素表达降低表明该干细胞脱离该干细胞群并进入了分化。整合素可以定位追踪干细胞。而标记物的确立对于上皮干细胞的分离、鉴定及功能特性的研究有重要意义。目前关于integrin-β1 在鼠下切牙齿颈环结构发育中的表达情况还没有系统的报道。本实验通过对大鼠下切牙颈环上皮细胞中integrin-β1的表达研究来探讨其意义。
1 材料和方法
1.1 主要试剂和仪器:DMEM-F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(均购置于Gibco,美国)。BCM型生物洁净台(北京),HH.B1.1-420BS型电热恒温培养箱(日本),SZX研究型体视显微镜(日本),OLYMPUSCX71显微镜及数码成像系统(日本)。
1.2 方法
1.2.1 胰酶-葡萄糖-庆大霉素(trypsin-glucose-gentamicin,TGG)细胞消化液的配制[1] 以PBS液100ml溶解0.1g葡萄糖及0.25g胰蛋白酶,经0.2μm滤膜过滤后,加入0.5μg/ ml庆大霉素,置-20℃冻存待用。用前与已灭菌的0.02 %EDTA(PBS液溶解)按1∶1比例混合。
1.2.2 鼠尾胶原制备:从大鼠根部剪断大鼠鼠尾,自来水、蒸馏水清洗后,放入75%乙醇中浸泡30 min,在超净工作台中将鼠尾切成1.5cm小段,剥去鼠尾皮毛,抽出尾腱,置于玻璃皿中。用眼科剪剪碎肌腱,转移入0.1%醋酸溶液中,密封,置4℃冰箱,并不时摇动。48h后移入灭菌的离心管中,以4000r/min,30 min离心,无菌条件下吸取上清液,-20℃冰箱中冻存。应用时用玻璃吸管将解冻的鼠尾胶原均匀涂布于培养皿底部,37℃孵箱过夜,用灭菌D-hank’s漂洗,超净工作台内晾干。
1.2.3Ⅳ型胶原包被培养皿:用20ug/ml的Ⅳ型胶原溶液1ml铺35mm培养皿的底部,置入4℃冰箱过夜,第2天吸掉未干燥的残留溶液,置37℃孵箱30min备用。
1.2.4 原代细胞分离培养:取10只出生2天的Wistar大乳鼠,脱颈处死后在75 %的乙醇中浸泡5min,体视显微镜下分离下切牙牙胚,置入2.5g/L的胰酶,4℃消化1.5小时,放入盛有含胎牛血清的培养基中终止消化。体视显微镜下机械剥离成釉器,并分离出颈环组织,置入鼠尾胶包被的培养皿,加入少量培养基,保持组织块湿润即可。置入37℃、50ml/L CO2、饱和湿度标准条件下孵育,3小时后加入3ml培养基,隔日换液。
1.2.5 颈环上皮细胞的纯化:待上述培养的细胞铺满培养皿底,并计数为1×106/ml后,加入TGG 37℃下振荡消化10～15min,10% FBS终止消化,1000r/min离心,弃上清,加入培养基,移至鼠Ⅳ型胶原包被的培养皿内,37℃下静置10～15min,待细胞贴壁后,更换培养基,置37℃、5 % CO2、饱和湿度的细胞培养箱内培养,隔日换液。经3-5 次换液,更换鼠Ⅳ型胶原包被的培养皿,并重复上述过程。
1.2.5 颈环上皮细胞的免疫组化染色:对纯化的细胞常规制备细胞爬片,一抗为兔抗鼠的β1整合素多克隆抗体,用0.1ml/L的PBS液替代一抗作空白对照。免疫化学染色过程按检测试剂盒说明,观察所培养细胞免疫细胞化学染色的情况。
2 结果
2.1 原代细胞分离培养:体视显微镜下分离下切牙牙胚,可见清楚的颈环结构(图1),组织切片可见内釉上皮、外釉上皮和中间层细胞(图2) ......
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