胰岛素经PI3K/Akt/p70S6K1信号通路促进小鼠成肌细胞的增殖(2)
参见附件(12kb)。
1.3 免疫印记:当C2C12细胞生长至80%融合时，用无血清的培养液处理12-16小时，加入胰岛素(终浓度200 nM)处理相应的时间后，收集细胞用于免疫印记检测[6]。具体的步骤为：弃去细胞上层培养液，用冰冷的PBS润洗一遍，用细胞刮子收集细胞于1.5ml离心管中，6000rpm4 ℃离心5分钟，弃去上清，加入含有各种蛋白酶抑制剂(1 mM sodium vanadate(正钒酸钠), 1 mM leupeptin(亮肽素), 1 mM aprotinin(抑肽酶), 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF，苯*****化物，), 1 mM dithiothreitol(DTT，二硫苏糖醇), 和1 mM pepstatin A(胃酶抑素A))的RIPA 缓冲液(100 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% Triton, 1% deoxycholic acid, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, and 2 mM NaF)，旋涡混匀，冰上放置30min，4 ℃12000rpm离心10min，取上清用Bio-Rad公司的Lowry 试剂盒测定总蛋白浓度，用96孔板中进行测定，操作按说明书进行。根据所测蛋白浓度，计算出各样品取相同上样量所需体积，进行免疫印迹实验，所选变性聚丙烯酰胺凝胶分离胶浓度为7%-10%。将样品与2×SDS上样缓冲液混合，于100℃煮沸5min后上样。恒压100V电泳，时间至样品染料指示剂至胶的下端。用湿转法100V 恒压转膜90分钟。然后，用丽春红染膜1-2min观察条带。用PBS/T洗膜2次，每次5min，用5%脱脂奶粉(PBS/T配制)封闭1小时，加入一抗4℃过夜。用洗膜液洗涤3次，每次5min，加入二抗作用1小时，再用洗膜液洗涤3次，每次10min。用ECL溶液(PE公司)进行发光反应，操作按照说明书进行。
1.4 细胞增殖实验:细胞增殖实验用MTT法检测[7]。取100 μl细胞悬液(约5000个细胞)于96孔板中，用血清培养液培养24小时，加入胰岛素(200 nM)作用 20小时，加入MTT溶液20 μl (5 mg/ml)孵育4小时，吸去上层液体，加入200 μl DMSO溶解紫色结晶，用分光光度计测量570 nm的吸光度。
1.5 统计学分析:数据用平均值±标准误表示，当两组间比较时用非配对t检验，多组间比较时用单因素方差分析进行统计学分析，P<0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 胰岛素对C2C12细胞的增殖作用:为明确胰岛素是否刺激C2C12细胞的增殖，用胰岛素处理细胞，MTT法检测细胞的增殖，结果表明胰岛素能浓度依赖性地增加C2C12细胞的增殖(如图1)。
Figure 1. Serum-starved C2C12 cells were cultured in the presence or absence of insulin (100 or 200 nM) for 24 hours. The MTT assay was performed as described in the Methods. Values are mean±SE from three replicate experiments. * and ** indicates significantly different when compared to the control (*P<0.05, **P<0.01).
2.2 胰岛素对C2C12细胞Akt的激活:Akt是一种蛋白激酶 ......
1.3 免疫印记:当C2C12细胞生长至80%融合时，用无血清的培养液处理12-16小时，加入胰岛素(终浓度200 nM)处理相应的时间后，收集细胞用于免疫印记检测[6]。具体的步骤为：弃去细胞上层培养液，用冰冷的PBS润洗一遍，用细胞刮子收集细胞于1.5ml离心管中，6000rpm4 ℃离心5分钟，弃去上清，加入含有各种蛋白酶抑制剂(1 mM sodium vanadate(正钒酸钠), 1 mM leupeptin(亮肽素), 1 mM aprotinin(抑肽酶), 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF，苯*****化物，), 1 mM dithiothreitol(DTT，二硫苏糖醇), 和1 mM pepstatin A(胃酶抑素A))的RIPA 缓冲液(100 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% Triton, 1% deoxycholic acid, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, and 2 mM NaF)，旋涡混匀，冰上放置30min，4 ℃12000rpm离心10min，取上清用Bio-Rad公司的Lowry 试剂盒测定总蛋白浓度，用96孔板中进行测定，操作按说明书进行。根据所测蛋白浓度，计算出各样品取相同上样量所需体积，进行免疫印迹实验，所选变性聚丙烯酰胺凝胶分离胶浓度为7%-10%。将样品与2×SDS上样缓冲液混合，于100℃煮沸5min后上样。恒压100V电泳，时间至样品染料指示剂至胶的下端。用湿转法100V 恒压转膜90分钟。然后，用丽春红染膜1-2min观察条带。用PBS/T洗膜2次，每次5min，用5%脱脂奶粉(PBS/T配制)封闭1小时，加入一抗4℃过夜。用洗膜液洗涤3次，每次5min，加入二抗作用1小时，再用洗膜液洗涤3次，每次10min。用ECL溶液(PE公司)进行发光反应，操作按照说明书进行。
1.4 细胞增殖实验:细胞增殖实验用MTT法检测[7]。取100 μl细胞悬液(约5000个细胞)于96孔板中，用血清培养液培养24小时，加入胰岛素(200 nM)作用 20小时，加入MTT溶液20 μl (5 mg/ml)孵育4小时，吸去上层液体，加入200 μl DMSO溶解紫色结晶，用分光光度计测量570 nm的吸光度。
1.5 统计学分析:数据用平均值±标准误表示，当两组间比较时用非配对t检验，多组间比较时用单因素方差分析进行统计学分析，P<0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 胰岛素对C2C12细胞的增殖作用:为明确胰岛素是否刺激C2C12细胞的增殖，用胰岛素处理细胞，MTT法检测细胞的增殖，结果表明胰岛素能浓度依赖性地增加C2C12细胞的增殖(如图1)。
Figure 1. Serum-starved C2C12 cells were cultured in the presence or absence of insulin (100 or 200 nM) for 24 hours. The MTT assay was performed as described in the Methods. Values are mean±SE from three replicate experiments. * and ** indicates significantly different when compared to the control (*P<0.05, **P<0.01).
2.2 胰岛素对C2C12细胞Akt的激活:Akt是一种蛋白激酶 ......
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