腹腔注射依托咪酯对老年大鼠认知功能的影响
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【中图分类号】R971【文献标识码】B【文章编号】1008-6455(2011)08-0459-01
依托咪酯是咪唑类衍生物，具有良好的镇静作用，其起效快，诱导迅速，对呼吸循环影响轻微，是老年病人麻醉的常用药物[1,2]。有研究表明，麻醉药物可能是术后认知功能障碍发生的原因之一[3]。依托咪酯在老年患者中是否产生术后认知功能障碍目前还不清楚，本研究拟探讨依托咪酯对老年大鼠认知功能的影响，对依托咪酯在老年患者应用的安全性进行评价。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及药品:依托咪酯，批号：7505C33，德国B.Braun公司提供；NMDAR一抗及二抗，由北京中杉生物制剂有限公司提供；Total RNA Ioslation System试剂盒、advantageTM RT-for-PCR Kit试剂盒、TITANIUM TM Taq PCR Kits试剂盒均由美国BD biosciencs Clontech公司提供。Western及细胞裂解液由江苏碧云天生物有限公司提供。
1.2 实验动物及分组:雄性Wistar大鼠(广东省动物实验中心提供)24只，月龄18月，体重350g～450g。随机分为3组(n8)：即对照组(C组)、腹腔单次注射依托咪酯组(E1)，腹腔多次注射依托咪酯组(E2)。E1组腹腔单次注射依托咪酯20 mg/kg；E2组腹腔注射依托咪酯 20 mg/kg，间隔2h再重复注射，连续注射三次；C 组腹腔注射等容量的生理盐水。
1.3 Morris水迷宫试验:于给药后1d(T1)、2d(T2)、3d(T3)、4d(T4) 和5d(T5)时，参照文献[4]采用的方法进行Morris水迷宫实验。选择一个象限的固定位置将大鼠入水，通过自动图像拍摄系统记录游泳轨迹，以入水时找到平台的时间为潜伏期，其总行程为游泳距离，每天测试4次，取其平均值。
1.4 western blot:水迷宫结束后60min时，断头处死大鼠，取海马，放置于-70℃冰箱保存备用，采用western blot方法测定海马N-甲基D-天冬氨酸受体(NMDAR)的表达。取脊髓标本，加入裂解液，匀浆，4℃14000g离心5分钟，取上清，加入4倍样本缓冲液，变性5分钟，将样本加至7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶恒压电泳，半干法转移至硝酸纤维素膜。3%BSA封闭3h，加入NMDAR一抗(1：200)，4℃孵育过夜。TBST冲洗15min×3次，加入辣根酶标记的兔抗羊二抗(1：500)，室温孵育1.5h，TBST冲洗15min×3次，DAB显色检测反应条带，以各组NMDRA表达与β-actin的比值为各组NMDAR的相对表达量。
1.5 RT-PCRNMDAR上游引物：5`-CACAGGAGAGGGTAAACAACAGCC-3`，下游引物5`-GAATCGGCCAAAGGGACTGAACC-3`，扩增片断长度为311 bp。取在-70℃冰箱中保存的海马大约50mg，参照Total RNA Ioslation System 试剂盒说明进行总RNA的提取。采用advantage TM RT-for-PCR Kit(BD biosciencs Clontech公司)，按照说明，将上述提取的总RNA进行逆转录获得cDNA。采用TITANIUM TM Taq PCR Kits(BD biosciencs Clontech公司)取上述所得的cDNA进行PCR，扩增条件：94℃预变性 3 min，94℃ 40s，55℃ 40s，72℃ 50s，35个循环后72℃延伸 5 min。所得产物电泳后，将凝胶置于Image Master VDS(Pharmacie Biotech，USA)，用Image Master 1D Version 2.0图像分析软件分析。PCR产物用光密度表示，以NMDAR cDNA条带和内参照条带的光密度的比值作为NMDAR的相对表达量。
表1 三组大鼠游泳潜伏期及游泳距离(x±s，n8)
与T1比较，*P<0.05,**P<0.01; 与C组比较，#P<0.05,##P<0.01。
1.6 统计学处理： 采用SPSS11.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间及组内比较采用单因素方差分析，P<005为差异有统计学意义。
2 结果
与T1比较，三组大鼠在T2～T5潜伏期及游泳距离逐渐缩短(P<0.05或0.01), 与C组比较，E2组大鼠潜伏期及游泳距离在T1和T2时间点明显延长(P<0.05)，T3～T5 时间点与C组无统计学意义(P>0.05)；E1组各时间点与C组比较无统计学意义(P>0.05),见表1。
与C组比较，E1 组NMDAR蛋白表达无统计学意义(P>0.05)，但E1组大鼠NMDAR mRNA表达增加(P<0.05)；E2组大鼠NMDAR蛋白及mRNA表达上调(P<0.01)，见表2。
表2 三组大鼠NMDAR蛋白表达及mRNA表达(,n8)
与C组比较，*P<0.05,**P<0.01
3 讨论
认知功能障碍(Postoperative cognitive dysfunction,POCD)是老年患者术后常见的并发症，麻醉药物可能是导致POCD发生的原因之一。 依托咪酯由于具有良好的呼吸循环稳定性，常常用于老年患者的麻醉诱导。本研究选择老年大鼠，观察依托咪酯单次给药和多次给药对其认知功能的影响。
Dixon等的研究表明[5]，依托咪酯预先给药可以减轻创伤性脑损伤，改善创伤后认知功能障碍，但创伤后给与依托咪酯其保护作用不如创伤前给药。在本实验中，各组大鼠在给药后潜伏期及游泳距离逐渐缩短，提示大鼠在此期间有一个学习记忆的过程发生。本实验提示单次注射依托咪酯对大鼠认知功能无影响，反复多次注射依托咪酯后可对大鼠的认知功能障碍产生一过性影响，但短期内可恢复。
依托咪酯作用于GABAA受体，通过竞争性地增加高亲和力结合位点的数目而增强与GABA的结合力，产生内向性Cl-电流。NMDAR是分布于神经元突触后膜上的特殊离子通道 ......
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