乙酰肝素酶、血管内皮生长因子和核因子-kB在原发性膜性肾病患者肾小球内的表达变化及意义(1)
【摘 要】目的：探讨乙酰肝素酶(Heparanase,Hpa)、血管内皮生长因子(VEGF)和核因子-kB(NF-kB)在原发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy，IMN)患者肾小球中的表达及与蛋白尿、血肌酐的关系。方法：用免疫组化法检测36例IMN患者与6例正常对照者肾小球内Hpa、NF-kB和VEGF的表达情况。结果：Hpa、VEGF和NF-kB在对照组正常肾组织的肾小球基底膜及肾小管上皮细胞仅有少量表达。IMN组肾小球内Hpa、VEGF、NF-kB表达较对照组均明显增强(p<0.01)。I期IMN组与II期IMN组比较，肾小球内Hpa、NF-kB的表达差异无显著性(p>0.05)。肾小球内VEGF表达差异有显著性(p<0.01)，II期IMN组较I期IMN组肾小球内VEGF表达减少。Hpa、NF-kB与24小时尿蛋白定量呈正相关关系， VEGF与24小时尿蛋白定量呈正相关趋势。Hpa与NF-kB之间呈正相关关系， Hpa与VEGF之间无明显相关性，但在I期IMN二者呈正相关关系， NF-kB与VEGF之间无明显相关性，但在I期IMN二者呈正相关关系。结论：NF-kB、Hpa的异常表达参与IMN的肾病理损害与蛋白尿的形成。 VEGF并非IMN患者肾小球损害与蛋白尿形成的主要参与者。相反，VEGF可能有助于IMN向好的方面转归。 Hpa、VEGF、NF-kB三者之间的作用互相制约。本实验结果可为IMN的治疗策略进一步提供参考，即适当下调NF-kB及Hpa有益于IMN的转归。
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【关键词】原发性膜性肾病；乙酰肝素酶；血管内皮生长因子；核因子-kB；蛋白尿
【中图分类号】R692.3 【文献标识码】A 【文章编号】1008-6455(2012)01-0037-03
原发性膜性肾病(IMN)是常见的原发性肾小球疾病。临床可表现为蛋白尿，甚至终末期肾功能衰竭(ESRD)。存在自限与恶化两种趋向，决定预后的因素、病因与发病机理并不十分清楚。Hpa是一种葡糖苷酸内切酶，可水解乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)。HSPG的减少可导致基底膜(GBM)的选择通透性改变以及肾小球上皮细胞和内皮细胞锚连位点的丧失，同时释放多种生长因子，包括成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、VEGF等[1-6]。VEGF是血管生成的主要调节者,具有促进血管生长和建立侧枝循环、改善血流动力学等生物学作用[7]。VEGF具有肾脏保护作用，有助于某些肾脏疾病的恢复[8-10]]。但也有相反观点，认为 VEGF能够减少GBM阴离子数目，诱导肾小球内皮细胞的小窗形成，故VEGF可能通过同时影响GBM的电荷屏障及机械屏障而调节肾小球通透性，VEGF分泌的异常增加可导致肾小球滤过膜对血浆蛋白的通透性增加，从而导致蛋白尿的形成[11]。 NF-kB是一种具有多向性调节作用的核转录因子，与多种基因特别是免疫炎症相关基因的转录调节密切相关。鉴于上述三个因子的作用尚未定论，且无三种因子在IMN患者肾小球内表达变化及其意义的系统报道，我们采用免疫组化方法同步检测Hpa、VEGF、NF-kB在IMN患者肾小球内的表达情况，以了解Hpa、VEGF、NF-kB之间的关系及其对IMN的影响，为IMN的治疗提供依据。
, 百拇医药
1 对象与方法
1.1 一般资料
病例来源于2005年11月至2007年8月间在本院肾内科病房诊治的36例原发性膜性肾病患者，所有患者均为首次经临床和病理确诊者。6例正常对照肾组织来自因肾脏良性肿瘤行一侧肾脏切除术患者，肾组织标本取自上述患者远离病灶周围的正常肾组织。
1.1.1 入选标准：肾组织所取标本经MASSON及MASSOM+PASM染色，在光镜下可见肾小球上皮下嗜复红蛋白沉积，肾小球基底膜弥漫均匀增厚、空泡变、或钉突形成、或链环样改变，且免疫荧光可见IgG、C3沿肾小球基底膜沉积的IMN患者。
1.1.2 排除标准：除外结缔组织病、肝炎病毒或慢性肝炎、恶性实体肿瘤相关性MN患者及肾穿刺活检前曾服用过皮质类固醇激素、细胞毒药物、他汀类降脂药物、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)及血管紧张素II受体拮抗剂(ARB)类药物的IMN患者。
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1.2 分组方法
1.2.1 实验组(IMN组)：36例IMN，男21例，女15例，平均年龄43岁。IMN组根据病理改变分期再分为两个亚组，其中I期IMN组30例，男18例，女12例，平均年龄45岁;II期IMN组6例,男3例,女3例,平均年龄33岁。
1.2.2 对照组：6例因肾脏良性肿瘤行一侧肾切除术患者，肾组织标本取自上述患者远离病灶周围的正常肾组织。男5例，女1例，平均年龄岁46岁。
1.3 临床观察指标
血清肌酐、白蛋白、24小时尿蛋白定量。
1.4 免疫组化检查
按SP法进行。肾组织切片3um，常规脱蜡、水化，3%H2O2室温下孵育。0.1mol/L枸橼酸盐缓冲液(PH6.0)中行高压抗原修复。10%正常山羊血清封闭。一抗分别为兔抗人乙酰肝素酶单克隆抗体(稀释1:75购自武汉博士德试剂公司)；兔抗人血管内皮生长因子单克隆抗体(稀释1:300)，兔抗人NF-kBp65单克隆抗体(稀释1:200购自碧云天试剂公司)，37℃孵育。生物素标记山羊抗兔、大鼠、小鼠和豚鼠IgG37℃孵育。辣根酶标记链酶卵白素工作液37℃孵育。DAB显色。苏木素复染。以PBS替代一抗作为阴性对照。
1.5 免疫组化结果判定
在胞浆或胞膜处有棕黄色或棕红色颗粒状物质沉积为阳性细胞。不着色为阴性。采用北航病理图像分析系统，通过光学显微镜放大400倍摄取图像，输入图像分析系统内，对图像进行灰度变换，使阳性面积与背景分开，进行自动测量。肾小球Hpa、VEGF和NF-kB免疫组化阳性面积测定：在光学显微镜计算机图像分析系统屏幕上，每例标本400倍镜下随机观察5个肾小球，分别计算每个指标的阳性面积与整个肾小球面积的比值，取其平均值作为每例标本每个指标肾小球阳性面积的比值。, 百拇医药(姚素花 王彦 陈凤慧)
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【关键词】原发性膜性肾病；乙酰肝素酶；血管内皮生长因子；核因子-kB；蛋白尿
【中图分类号】R692.3 【文献标识码】A 【文章编号】1008-6455(2012)01-0037-03
原发性膜性肾病(IMN)是常见的原发性肾小球疾病。临床可表现为蛋白尿，甚至终末期肾功能衰竭(ESRD)。存在自限与恶化两种趋向，决定预后的因素、病因与发病机理并不十分清楚。Hpa是一种葡糖苷酸内切酶，可水解乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)。HSPG的减少可导致基底膜(GBM)的选择通透性改变以及肾小球上皮细胞和内皮细胞锚连位点的丧失，同时释放多种生长因子，包括成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、VEGF等[1-6]。VEGF是血管生成的主要调节者,具有促进血管生长和建立侧枝循环、改善血流动力学等生物学作用[7]。VEGF具有肾脏保护作用，有助于某些肾脏疾病的恢复[8-10]]。但也有相反观点，认为 VEGF能够减少GBM阴离子数目，诱导肾小球内皮细胞的小窗形成，故VEGF可能通过同时影响GBM的电荷屏障及机械屏障而调节肾小球通透性，VEGF分泌的异常增加可导致肾小球滤过膜对血浆蛋白的通透性增加，从而导致蛋白尿的形成[11]。 NF-kB是一种具有多向性调节作用的核转录因子，与多种基因特别是免疫炎症相关基因的转录调节密切相关。鉴于上述三个因子的作用尚未定论，且无三种因子在IMN患者肾小球内表达变化及其意义的系统报道，我们采用免疫组化方法同步检测Hpa、VEGF、NF-kB在IMN患者肾小球内的表达情况，以了解Hpa、VEGF、NF-kB之间的关系及其对IMN的影响，为IMN的治疗提供依据。
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病例来源于2005年11月至2007年8月间在本院肾内科病房诊治的36例原发性膜性肾病患者，所有患者均为首次经临床和病理确诊者。6例正常对照肾组织来自因肾脏良性肿瘤行一侧肾脏切除术患者，肾组织标本取自上述患者远离病灶周围的正常肾组织。
1.1.1 入选标准：肾组织所取标本经MASSON及MASSOM+PASM染色，在光镜下可见肾小球上皮下嗜复红蛋白沉积，肾小球基底膜弥漫均匀增厚、空泡变、或钉突形成、或链环样改变，且免疫荧光可见IgG、C3沿肾小球基底膜沉积的IMN患者。
1.1.2 排除标准：除外结缔组织病、肝炎病毒或慢性肝炎、恶性实体肿瘤相关性MN患者及肾穿刺活检前曾服用过皮质类固醇激素、细胞毒药物、他汀类降脂药物、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)及血管紧张素II受体拮抗剂(ARB)类药物的IMN患者。
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1.2 分组方法
1.2.1 实验组(IMN组)：36例IMN，男21例，女15例，平均年龄43岁。IMN组根据病理改变分期再分为两个亚组，其中I期IMN组30例，男18例，女12例，平均年龄45岁;II期IMN组6例,男3例,女3例,平均年龄33岁。
1.2.2 对照组：6例因肾脏良性肿瘤行一侧肾切除术患者，肾组织标本取自上述患者远离病灶周围的正常肾组织。男5例，女1例，平均年龄岁46岁。
1.3 临床观察指标
血清肌酐、白蛋白、24小时尿蛋白定量。
1.4 免疫组化检查
按SP法进行。肾组织切片3um，常规脱蜡、水化，3%H2O2室温下孵育。0.1mol/L枸橼酸盐缓冲液(PH6.0)中行高压抗原修复。10%正常山羊血清封闭。一抗分别为兔抗人乙酰肝素酶单克隆抗体(稀释1:75购自武汉博士德试剂公司)；兔抗人血管内皮生长因子单克隆抗体(稀释1:300)，兔抗人NF-kBp65单克隆抗体(稀释1:200购自碧云天试剂公司)，37℃孵育。生物素标记山羊抗兔、大鼠、小鼠和豚鼠IgG37℃孵育。辣根酶标记链酶卵白素工作液37℃孵育。DAB显色。苏木素复染。以PBS替代一抗作为阴性对照。
1.5 免疫组化结果判定
在胞浆或胞膜处有棕黄色或棕红色颗粒状物质沉积为阳性细胞。不着色为阴性。采用北航病理图像分析系统，通过光学显微镜放大400倍摄取图像，输入图像分析系统内，对图像进行灰度变换，使阳性面积与背景分开，进行自动测量。肾小球Hpa、VEGF和NF-kB免疫组化阳性面积测定：在光学显微镜计算机图像分析系统屏幕上，每例标本400倍镜下随机观察5个肾小球，分别计算每个指标的阳性面积与整个肾小球面积的比值，取其平均值作为每例标本每个指标肾小球阳性面积的比值。, 百拇医药(姚素花 王彦 陈凤慧)