人工栽培虫草的工艺研究与分析
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摘要：培养基是人们提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的具有多种营养成分的混合物。培养基的组成对微生物的生长繁殖、生物合成、分离纯化以及产品的质量和产量都有重要影响。本研究就是以正交设计的方法，在以往使用的培养基中加入鲜活蚕蛹的蛹液，来进一步筛选配出更适合于冬虫夏草生长的培养基。通过实验证明：纯蛹液的培养基菌丝发出的最早，生长的最高、最密、颜色最深，大米加15%的蛹液的培养基最先形成原基。
关键词：冬虫夏草，蛹虫草，培养基。
冬虫夏草(Cordyceps sinensis)简称虫草，是麦角科虫草真菌，寄生于鳞翅目蝙蝠蛾科(Hepialus)昆虫的子座及幼虫尸体的复合物，其本质是一种虫生真菌。
天然冬虫夏草主要分布于我国青海、云南、四川、西藏等地，是我国传统的名贵中药。《本草从新》中记载：冬虫夏草具有“保肺益肾、止血化痰”的药用功效。赵学敏在《本草纲目拾遗》中把虫草的治疗作用归之为“能治百虚损”。近年来的药理研究，也证实了冬虫夏草有明显的扩张支气管、抑制心跳、镇静、催眠、抑菌、抗病毒、抗癌等功效。因而，在临床上用来治疗肺结核、咳嗽、神经衰弱、慢性肾炎、肿瘤等疾病。同时它还能调节免疫功能，增强人体的抗病能力 [1]。
由于天然冬虫夏草生长所要求的寄主严格及生态地理环境非常特殊，加之近年来人为的乱采乱挖，破坏了生态环境，使天然冬虫夏草的资源遭到了严重的破坏，产量也急剧下降。随着现代人们保健意识的不断增强，虫草的需求量却在不断增加。为了解决这一矛盾，我国的科技工作者做了大量的研究工作[2]。
首先通过人工栽培，成功地培养出北冬虫夏草的子实体[3]；接着又将天然的冬虫夏草与人工栽培的北冬虫夏草的有效成分、药理作用及临床效果等方面做了大量的对比实验。结果发现：天然的冬虫夏草与人工栽培的北冬虫夏草的有效成分、药理作用及临床效果非常相似[4]。这就为人工培养冬虫夏草子实体代替天然的冬虫夏草提供了科学依据。目前的栽培方法是在罐头瓶中加入适量大米、营养液，制成培养基后接种冬虫夏草菌丝体培养或在该培养基中再加入蚕蛹干粉以增加营养成分；也见有在该瓶中长出菌丝体后再放入整体消毒的柞蚕蛹或直接往柞蚕蛹体内注射菌丝体的报道[5] 。
本研究旨在通过改变原有培养基的配比，寻找一种更适合于冬虫夏草生长、产量高、其有效成分及药理作用与野生冬虫夏草更接近的培养基，即在前人用罐头瓶中加入适量大米、营养液，或水制成的培养基的基础上，再加入适量的鲜活蛹液或纯蛹液来制作培养基，以此来提高培养基的营养成分，使其更接近野生冬虫夏草的营养条件。经过一段时间的培养，结果表明：本实验组不论在菌丝体的萌发，原基的形成时间及色泽等，均优于以往的培养基。
材料与方法
1. 材料
1.1培养基原料：营养液、蛹液、大米、水
1.1.1营养液
蛋白胨0.5g 葡萄糖 2.0g
MgSO4 0.06gKH2PO4 0.1g
维生素B1 10mg/L pH 7.0-7.2
加水稀释5倍。
1.1.2蛹液
先购买鲜活柞蚕蛹,用豆浆机打碎备用。另备大米、自来水
1.1.3聚丙烯薄膜100mm×100mm；500ml玻璃罐头瓶洗净后用烘箱烘干。
1.1.4封口胶皮套直径25mm
1.2供试菌株:北冬虫夏草[Cordyceps militaris]由沈阳中天生物工程有限公司提供。
1.3仪器：A.HPG-280B光照培养箱哈尔滨市东联电子技术开发有限公司
B.pHS-3C型酸度计 上海虹益仪器厂
C.银州牌628型立式压力蒸汽消毒器 铁岭市医疗器械总厂
1.4试剂: H2SO4 分析纯 北京化学试剂公司
MgSO4 分析纯 沈阳市试剂三厂
KIO4 分析纯 沈阳市试剂三厂
KI 分析纯 沈阳市试剂一厂
Na2S2O3 分析纯 沈阳市试剂一厂
2.方法:
2.1本实验根据不同成分、不同浓度,共配成5种9组培养基。见表1.
2.2灭菌：按表1配成各培养基后分别加入400ml干净罐头瓶中(每组3个),用聚丙烯薄膜盖好,用胶皮套勒紧瓶口，进行高压灭菌，待沸腾(上汽)5分钟后压阀,升至0.14-0.15Mpa 40分钟后闭火，出锅晾凉待接种。
2.3接种：按无菌操作规程每瓶培养基接种菌种片约5×10mm及菌丝液5 ml。
2.4培养：
培养条件：(每种配方各三瓶)在避光、230C-240C恒温箱内培养，20天后取出，置室内无直射光处培养。
2.5观察：在各种配比培养基上北冬虫夏草的生长状况即：
2.5.1最初萌发菌丝的时间、及菌丝的长短、浓密程度、覆盖培养基表面的情况、色泽的深浅等
2.5.2原基形成的时间
2.5.3子实体的长度
2.5.4子实体的粗细(平均直径)
2.5.5子实体的平均产量
2.5.6子实体的颜色
2.5.7各培养条件的影响。
结果与讨论
3.1结果
3.1.1在培养至第3天时，在光照培养箱中(23.70C)培养的各瓶，肉眼观察在接种部位都长出了白色菌丝，菌丝生长覆盖面积均小于30%。
3.1.2在培养至第10天时观察，有3组的黄白色虫草菌丝覆盖面积达到了100%。见表2。在全部是蛹液的培养基上的虫草菌丝生长的最好。
在培养基中加大米且没有营养液的情况下，菌丝的覆盖面积与加蛹液有关即15%、25%生长较好5生长最好，但与营养液的含量成反比，有营养液的如1a 50%、1b 75%、1c 85%、3 100%最差。
3.1.3.在培养至第10天时观察到各组培养基上的菌丝生长情况如表3
3.1.4在培养至第20天时
3.1.5在培养至20天时，见到在2a、2b、2c、4的培养基上已长出原基，这表明蛹液加大米及水加大米组不但在菌丝阶段生长最好，而且还适合原基的形成。
3.2讨论
3.2.1本次实验证明了在加入大米的情况下，加鲜活蛹液的培养基在冬虫夏草菌丝生长阶段要优于只加营养液、水组，这是最大成功之处。纯蛹液的培养基，虽适合冬虫夏草的菌丝生长，即在菌丝生长阶段，可以使菌丝全部覆盖培养基的时间最短，菌丝生长的最浓密，颜色最深，但却不适合原基的形成。考虑到培养基的内部结构，有大米者内部较松散，而全蛹液者则致密，推断可能是与该培养基的密度大有关，但尚待进一步证实。
3.2.2表2.说明在原有培养基中加入蛹液可促进最初菌丝的生长，即在有大米的情况下其生长的速度随蛹液的浓度增高而加快全部是蛹液的培养基菌丝生长的最快。
3.3.3表3.说明在有大米的情况下,加有蛹液的培养基可使菌丝长得浓密;长出的菌丝随蛹液浓度的减少而加长;颜色也是随蛹液浓度的减少而越白;
3.3.4培养至20天时，在2a、2b、2c、4的培养基上，已清晰可见有原基萌出(2mm)，2c为高，原基簇最多；2b次之，2a、4的顺序排列。在大米加水的基础上，再加上15%的蛹液，不但可促进菌丝阶段生长良好，也可使原基萌发早于其它实验组。
关于加入鲜蚕蛹液后制成的培养基与以往的培养基在子实体生长方面有何差异、营养成分有何差异，鲜蛹液浓度的最佳比值等，还有待进一步实验、观察。
结论：
就本实验现阶段观察结果来看，在大米中加入鲜蚕蛹液后制成的培养基(1).灭菌容易实现、(2)营养成分更接近野生蝙蝠蛾幼虫、(3)菌丝生长快，因此要优于以往的培养基。本实验研究为今后生产冬虫夏草提供了新的方法。
参考文献
1.刘茵华药用真菌历史考中国食用菌 199918(4)29
2.于自净人工虫草菌丝体开发与临床应用 于自净 时珍国医国药 199910(1)62～63
3.张民生冬虫夏草研究概况中国食用菌 200120 (5)37
4.严清波等 名贵珍稀菇菌栽培新法科学技术文献出版社2001 67～104
5.胡嵘等冬虫夏草人工培养的研究长春中医学报1997 (1)57, 百拇医药(王常鑫 杨春伟)