安神益智方对老年痴呆症模型小鼠学习记忆能力及脑组织内自由基代谢的影响研究(2)
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准蛋白含量及蛋白含量必须用生理盐水稀释至1.3g/L(1.3mg/mL)以下，此范围内呈线性关系。蛋白含量高的样品请用双缩脲试剂进行测定，测试范围为1—15mg/mL。②超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒测试法(羟胺法)：取10%的脑组织匀浆液再稀释10倍，制成l%的脑组织匀浆。与试剂用旋涡混匀器混匀，置37℃恒温水浴40min，室温静置10min，于550nm处，1cm光径，蒸馏水调零，用u-3010紫外分光光度计测各管吸光度。③丙二醛(MDA)测定试剂盒测试法(硫代巴比妥酸TBA法)：取10%的脑组织匀浆液0.2mL与试剂旋涡混匀器混匀，试管口用薄膜扎紧，刺一小孔，95℃水浴40min，取出后流水冷却，然后3500—4000r/min，离心10min。取上清，532nm处，1cm光径，蒸馏水调零，用u-3010紫外分光光度计测各管吸光度值。④脂褐素(LF)测定(荧光比色法)：取水相组织匀浆1mL，在1mL匀浆中加入经500C预热后的氯仿甲醇混合液2mL：在旋涡混匀器上抽提30s间歇10s，共抽提3次。30000r/min离心10min，此时样品分3层，上层为水相，中层为组织沉淀层，下层为氯仿甲醇相。吸取上层水相，再用带长麻醉针头的针筒沿管壁穿透中层，吸取下层氯仿甲醇液。向氯仿甲醇提取物中加人0.1mL的试剂，轻轻摇匀，使之澄清透明。将上述液体置紫外灯下放置60S，倒入石英比色杯中，用取有机相用u-3010紫外分光光度计(日本日立)测其荧光强度。以0.1μg/mL的奎宁标准液，氯仿甲醇混合液为空白，发射波长420nm，激发波长360nm测定荧光强度。
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2.3统计学方法
本实验全部数据采用SPSS12.0版统计软件包处理。潜伏期及5min内的错误次数结果均用x±s表示，组间比较用单因素方差分析，两两比较用q检验，检验水准：a=0.05。
3 结果
3.1 中药对东莨菪碱所致小鼠学习记忆获得性障碍影响
结果表明，中药可使小鼠错误次数低于模型组，可使潜伏期明显延长(P<0.01)，提示中药对东莨菪碱所造成的记忆获得性障碍均有明显的改善作用，而与脑复康组比较差异无显著性(p>0.05)，见表1。
3.2 中药对亚硝酸钠致小鼠记忆巩固障碍的影响
模型组测试潜伏期缩短，错误次数增多，与正常组比较差异显著，说明模型组小鼠学习记忆巩固出现障碍。与模型组比较，中药组小鼠测试潜伏期均明显延长，错误次数有一定程度的减少(P<0.01)。脑复康组小鼠测试潜伏期明显延长，测试错误次数显著减少(P<0.01)。结果表明，中药对亚硝酸钠所致小鼠学习记忆巩固障碍有明显的改善作用，但弱于脑复康，结果见表2。
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3.3 中药对乙醇致小鼠记忆再现障碍的影响
结果显示，在灌乙醇之后，与模型组相比，对照组、脑复康组，中药组的潜伏期明显延长(P<0.01—0.05)，错误次数明显减少(P<0.05)，而中药组与脑复康组比较差异无显著性。说明中药具有拮抗乙醇所致小鼠学习记忆再现障碍的作用，结果见表3。
3.4脑内自由基代谢指标的影响(SOD MDA LF)
模型组小鼠SOD活性明显降低，MDA及LF含量明显升高，与正常组比较差异显著(P<0.01)，说明模型组抗氧化作用明显减弱，自由基明显增多。与模型组比较，中药组SOD活性明显升高，MDA及LF含量明显下降(P<0.01)；与脑复康组比较差异无显著性(P≥0.05)。实验结果表明，中药有明显升高小鼠痴呆的抗氧化能力，降低氧自由基对机体的损伤。阻抑了LF堆积，结果见表4。
4 讨论
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祖国医学将AD病归属于呆病、文痴、善忘、郁证、癫证等范畴，认为其病位在脑，与心肾肝脾关系密切。其主要病机分为虚实两端。虚证以肝肾阴亏、心脾气虚及阳虚为主；实证以痰、瘀、火、郁为主。临床治疗多以补肾填精、活血通窍、益气养血、清热涤痰开窍等为治疗大法。安神益智方由人参6g，熟地9g，当归9g，炒白术5g，炙甘草3g，酸枣仁6g，制远志5g组成，具有补气养血，安神益智作用，临床运用多年，疗效显著，本次实验研究也证实了其治疗AD病的良好作用。
记忆过程通常分为获得，巩固和再现3个阶段。记忆障碍模型是评价药物对记忆过程影响的有效手段。其动物模型的制备方法较多，主要有用某些化学药品、电休克，脑部缺血、缺氧，应激，剥夺睡眠等。近年来，多采用化学药品致记忆障碍模型。本实验选用中枢M-胆碱受体阻滞剂氢溴酸东莨菪碱，该药能特异性阻滞由第一级记忆向第二级记忆转移过程；采用训练前给药以破坏动物识记过程，造成记忆获得障碍；选用亚硝酸盐大量进人机体后，可使正常的血红蛋白变为高铁血红蛋白，失去携带氧的功能，引起组织缺氧，损害学习和记忆过程；用乙醇抑制大脑皮层的神经功能活动抑制动物的条件反射过程，使脑内蛋白质和RNA合成受阻，胆碱能和多巴胺等系统发生改变，破坏学习记忆功能，在测试前给药，造成记忆再现障碍。经过中药治疗，小鼠跳台测试结果显示：中药能明显减少东莨菪碱所致学习记忆障碍小鼠5min内错误次数；对亚硝酸钠所致小鼠学习记忆巩固障碍有明显的改善作用；具有拮抗乙醇所致的小鼠学习记忆再现障碍的作用。表明中药对小鼠具有相当的增强学习记忆作用。
自由基的毒副作用可引起与痴呆及机体的衰老进程相关的机体组织、细胞的退行性变化，能引起脂代谢异常而产生过多的LF及MDA等，从而损害细胞膜，细胞器和酶的功能，并使DNA发生突变、交联，单链断裂等结构和功能改变，进而致使细胞退化、变性、凋亡，线粒体膜流动性下降，黏滞性增加。自由基在脑内可通过脂质过氧化物等作用造成组织细胞和器官的退行性变化，从而加速痴呆进程。当机体处于正常生理状态时，自由基不断产生，同时不断地被清除，SOD可以催化超氧化物自由基歧化，有效地清除，发挥抗氧化作用。实验结果提示中药能有效清除脑内的氧自由基，减少了自由基对神经系统的损害，减少过多的脂褐素。从而从自由基方面证明了中药对痴呆动物的改善作用。
[ 上 页 ], 百拇医药(朱未名 胡海燕)