加减清营汤对H2 02损伤的血管内皮细胞存活率和SOD活力的影响(1)
 |
 |
摘要：目的：观察加减清营汤对H202损伤的血管内皮细胞存活率和SOD活力的影响。方法：体外培养内皮细胞ECV304，用3801xmol/L H2o2损伤细胞，随机分成正常组、模型组、血清对照组、丹参组、加减清营汤含药血清组。用血清药理学方法给药，继续培养后应用MIT法观察细胞存活率，检测SOD。结果表明：加减清营汤含药血清组MTT的OD值在24h点高于H202模型组(P0.05)，36h后与血清对照组有明显差异(P2O2对ECV。的损伤程度，其机理可能与抗氧化作用有关。
关键词：加减清营汤；血栓闭塞性脉管炎；H202；血管内皮细胞；MTT；SOD
中图分类号：R285.5
文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2008)01-0141-03
血栓闭塞性脉管炎(TAO)属中医学“脱疽”范畴，是一种常见的周围血管疾病，其发病率居周围血管病的第2位，多见于青壮年男性。临床以加减清营汤治疗TAO的疗效已得到证实，实验研究亦观察到该方的作用机理与改善血液流变学状态、降低全血黏度和血浆黏度、抑制血小板聚集功能、改善血液循环状态有关。为深入探讨该方治疗TAO的机制，本实验采用体外细胞培养方法，用H2O2诱导血管内皮细胞损伤模型，研究加减清营汤对内皮细胞存活率和SOD活力的影响。现将结果报道如下。
1 实验材料
1.1 细胞药物及试剂人脐静脉血管内皮细胞株(EcV304)：购自中国科学院上海生物化学研究所，中国科学院典型培养物保藏委员会。加减清营汤：全方由丹参、赤芍、生地、金银花、连翘、毛冬青等组成，制成100%煎剂(即lmL/lg生药)，药物由本校国医堂门诊部药房提供，符合2005版药典要求。
丹参注射液：江苏神龙药业有限公司生产，批号：0506143。RPIM-1640培养粉：GIBCO，USA，批号：2535081。小牛血清：杭州四季青生物工程材料研究所，批号：040603。胰蛋白酶：Typrin，1：250，Amerso，USA，批号：0428S05。四甲基偶氮唑盐：NTr，Bioshorp，批号：G793。二甲基亚砜：上海凌峰化学试剂有限公司，批号：050718。超氧化物歧化酶(sOD)测定试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号：20041221。30%过氧化氢：H2o2，分析纯，上海久忆化学试剂有限公司，批号20060910。
1.2 动物 SD雄性大鼠8只，体重(280±20)g，由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供，合格证号：SCXK2003-0003。
1.3 仪器5%Co2培养箱(NAPCO，USA)；倒置相差显微镜(Olympus，Japan)；酶联免疫检测仪(BIO-RAD，USA)。
2 实验方法
2.1 药物血清的制备加减清营汤水煎剂以人临床用量×动物等效剂量比值×血清稀释度为参考浓度给给大鼠连续灌胃3天，每天2次，正常对照组给予等量蒸馏水。于末次给药后1h(灌药前禁食不禁水12h)，颈动脉取血。以1000r/min离心15mln，分离血清，然后56℃ 30mln灭活以除去补体，再用0.22ttm的微孔滤膜过滤除菌，密封后置于-20℃冰箱保存备用。
2.2 细胞培养用传代人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)作细胞培养，按照常规方法复苏，将收获细胞用培养液悬浮后，种植于培养瓶内，置37℃ 5%co2培养箱内培养2天，待细胞生长至80%融合时，用于实验。
2.3 分组与处理将呈对数生长期的ECv304以105/cm2的密度接种于96孔板，分为5组，待细胞长至融合后，除正常组外，其余各组在造模前均用不含血清的培养液以增强细胞对H2O2损伤的敏感性。即：(1)正常组。含10%小牛血清的培养液；(2)模型组：加H2O2(终浓度为380ttmol/L)、不含血清的培养液；(3)血清对照组：加H2O2(终浓度为380ttmol/L)、含10%正常大鼠血清的培养液；(4)丹参组：加H2 02(终浓度为380；tmol/L)、含10%丹参注射液(终浓度为0.5g/L)的培养液；(5)加减清营汤含药血清组：加H2O2(终浓度为380umol/L)、含10%加减清营汤药物血清的培养液；操作完成后，置于37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱中分别培养24、36h。 2.4 MTF法测定细胞活性往96孔板加入5mg/mL浓度的MTr,37℃培养4h。再加入100UL DMSO震荡15min，待细胞线粒体代谢MTT所形成的甲(月朁)充分溶解后，用酶联免疫检测仪按参比波长为490rim，测定各孔吸收OD值。
2.5 SOD测定取各组细胞上清液100UL，按试剂盒方法进行操作。
2.6 统计处理计量资料用均数±标准差(X±S)表示。应用SPSS11.0软件进行统计学处理，采用多个样本均数间比较的方差分析和两两比较的q检验。a=0.05为显著性检验水准。
3 结果
见表1-2。
结果显示：模型组OD值明显低于其他各组，且差别有统计学意义(P0.05)，在36h OD值高于血清对照组，且差别有统计学意义(P0.05)外，与其他各组均有差别，且差别有统计学意义(P<0.01)；加减清营汤组SOD活性明显高于其他各组，且差别有统计学意义(P<0.01)。
4 讨论
血栓闭塞性脉管炎(TAO)属中医“脱疽”范畴，除了瘀血，营热、阴损也是其重要的病理因素，临床可见局部红肿破溃，痛如火灼，甚则毛发枯槁，肉腐筋烂，或局部皮肤干燥、脱屑、皲裂，汗毛脱落、稀疏或生长停止，趾(指)甲近增厚或薄脆变形、生长缓慢，肌肉萎缩，形体消瘦，舌绛脉细等(王 敏 傅 雷 江励华 吴颢昕 何文彬)
参见：首页 > 中医药 > 中医专业 > 中医方剂 > 常用方剂 > 清热剂 > 清营凉血 > 清营汤 濠电姷鏁搁崕鎴犲緤閽樺娲偐鐠囪尙顦┑鐘绘涧濞层倝顢氶柆宥嗙厱婵炴垵宕弸銈嗐亜閳哄啫鍘撮柡灞剧☉閳藉宕￠悙宸骄闂佸搫顦弲婊兾涢崘顔艰摕婵炴垶菤閺嬪酣鐓崶銊﹀皑闁稿鎸荤粋鎺斺偓锝庝簽閸旓箑顪冮妶鍡楀潑闁稿鎹囬弻娑㈡偐瀹曞洢鈧帗淇婇崣澶婂闁宠鍨垮畷鍫曞煘閻愵剛浜欓梺璇查缁犲秹宕曢崡鐐嶆稑鈽夐姀鐘靛姦濡炪倖甯掗ˇ顖炴倶閿旂瓔娈介柣鎰▕閸庢梹顨ラ悙鍙夊枠妞ゃ垺妫冨畷銊╊敇閻愰潧鎼稿┑鐘垫暩閸嬬娀骞撻鍡楃筏闁诡垼鐏愬ú顏勭闁绘ê鍚€缁楀姊洪幐搴ｇ畵闁瑰嘲顑夊畷鐢稿醇濠㈩亝妫冮弫鍌滅驳鐎ｎ亜濡奸梻浣告憸閸嬬偤骞愰幎钘夎摕闁哄洢鍨归獮銏ゆ煛閸モ晛孝濠碘€茬矙閺岋綁濮€閳轰胶浠╃紓鍌氱Т閿曨亪鐛繝鍥ㄦ櫢闁绘ǹ灏欓悿鈧俊鐐€栭幐楣冨磻閻斿摜顩烽柟鎵閳锋垿鏌涢敂璇插笌闁荤喐鍣村ú顏勎ч柛銉厛濞肩喖姊洪崘鍙夋儓闁瑰啿姘︾换姘舵⒒娴ｅ懙褰掑嫉椤掑倻鐭欓柟鐑橆殕閸婂灚銇勯弬鍨挃缁炬儳銈搁弻锟犲礃閵娿儮鍋撶粙鎸庢瘎婵犵數濮幏鍐礋閸偆鏉归柣搴㈩問閸犳牠鎮ラ悡搴ｆ殾婵せ鍋撳┑鈩冪摃椤︽娊鏌涢幘鏉戠仸缂佺粯绋撻埀顒佺⊕宀ｅ潡鎯屾繝鍋芥棃鎮╅崣澶嬪枑闂佽桨绶￠崳锝夈€侀弴銏℃櫆闁芥ê顦介埀顒佺☉閳规垿鏁嶉崟顐＄捕婵犫拃鍛珪缂侇喗鐟︾换婵嬪炊閵娧冨箰濠电姰鍨煎▔娑㈡晝閵堝姹查柡鍥╁枑閸欏繘鏌ｉ悢鐓庝喊婵☆垪鍋撻梻浣芥〃缁€浣虹矓閹绢喗鍋╂繝闈涱儏缁€鍐┿亜椤撶喎鐏ｉ柟瀵稿厴濮婄粯鎷呯粵瀣異闂佸摜濮甸幑鍥х暦濠靛﹦鐤€婵炴垼椴搁弲锝囩磽閸屾瑧鍔嶅畝锝呮健閸┿垽寮崼鐔哄幗闂佺懓顕崕鎴炵瑹濞戙垺鐓曢柡鍌氱仢閺嗭綁鏌″畝瀣瘈鐎规洘甯掗～婵嬵敇閻橀潧骞€缂傚倸鍊烽悞锕傘€冮崨姝ゅ洭鏌嗗鍛姦濡炪倖甯掗崰姘缚閹邦喚纾兼い鏃囧亹缁犲鏌ㄥ┑鍫濅槐闁轰礁鍟村畷鎺戭潩閸楃偞鎲㈤梻浣藉吹婵炩偓缂傚倹鑹鹃埢宥夋晲閸モ晝鐓嬮梺鍓茬厛閸犳捇鍩€椤掍礁绗掓い顐ｇ箞椤㈡﹢鎮╅锝庢綌闂傚倷绶氬ḿ褍煤閵堝悿娲Ω閳轰胶鍔﹀銈嗗笒閸嬪棝寮ㄩ悧鍫㈢濠㈣泛顑囧ú瀵糕偓瑙勬磸閸ㄨ姤淇婇崼鏇炵倞闁靛ǹ鍎烘导鏇㈡煟閻斿摜鐭屽褎顨堥弫顔嘉旈崪鍐◤婵犮垼鍩栭崝鏍磻閿濆鐓曢柕澶樺灠椤╊剙鈽夐幘鐟扮毢缂佽鲸甯楀ḿ蹇涘Ω瑜忛悾濂告⒑瑜版帩妫戝┑鐐╁亾闂佽鍠楃划鎾诲箰婵犲啫绶炲璺虹灱濮婄偓绻濋悽闈涗粶妞ゆ洦鍘介幈銊︺偅閸愩劍妲梺鍝勭▉閸樺ジ宕归崒鐐寸厪濠电偟鍋撳▍鍡涙煕鐎ｃ劌濡奸棁澶愭煥濠靛棙鍣归柡鍡欏枑娣囧﹪顢涘鍗炩叺濠殿喖锕ュ浠嬨€侀弴銏℃櫜闁糕剝鐟﹂濠氭⒒娴ｈ櫣甯涢柟纰卞亞閹广垹鈹戠€ｎ剙绁﹂柣搴秵閸犳牜绮婚敐鍡欑瘈濠电姴鍊搁顐︽煙閺嬵偄濮傛慨濠冩そ楠炴劖鎯旈敐鍌涱潔闂備礁鎼悧婊堝礈閻旈鏆﹂柣鐔稿閸亪鏌涢弴銊ュ季婵炴潙瀚—鍐Χ閸℃鐟愰梺缁樺釜缁犳挸顕ｉ幎绛嬫晜闁割偆鍠撻崢閬嶆⒑閻熺増鎯堢紒澶嬫綑閻ｇ敻宕卞☉娆戝帗閻熸粍绮撳畷婊冾潩椤掑鍍甸梺闈浥堥弲婊堝磻閸岀偞鐓ラ柣鏂挎惈瀛濋柣鐔哥懕缁犳捇鐛弽顓炵妞ゆ挾鍋熸禒顖滅磽娴ｆ彃浜炬繝銏ｆ硾閳洝銇愰幒鎴狀槯闂佺ǹ绻楅崑鎰枔閵堝鈷戠紓浣贯缚缁犳牠鏌ｉ埡濠傜仩闁伙絿鍏橀弫鎾绘偐閼碱剦妲伴梻浣藉亹閳峰牓宕滃棰濇晩闁硅揪闄勯埛鎴︽偣閸ワ絺鍋撻搹顐や簴闂備礁鎲￠弻銊︻殽閹间礁鐓濋柟鎹愵嚙缁狅綁鏌ｉ幇顓熺稇妞ゅ孩鎸搁埞鎴︽偐鐠囇冧紣闂佸摜鍣ラ崹鍫曠嵁閸℃稑纾兼慨锝庡幖缂嶅﹪骞冮埡鍛闁圭儤绻傛俊閿嬬節閻㈤潧袥闁稿鎹囬弻鐔封枔閸喗鐏撶紒楣冪畺缁犳牠寮婚悢琛″亾閻㈢櫥鐟版毄闁荤喐绮庢晶妤呮偂閿熺姴钃熸繛鎴欏灩缁犳娊鏌￠崒姘辨皑闁哄鎳庨埞鎴︽倷閸欏娅ｉ梻浣稿簻缁茬偓绌辨繝鍥х妞ゆ棁濮ゅ▍銏ゆ⒑鐠恒劌娅愰柟鍑ゆ嫹