加减清营汤对H2 02损伤的血管内皮细胞存活率和SOD活力的影响(1)
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摘要：目的：观察加减清营汤对H202损伤的血管内皮细胞存活率和SOD活力的影响。方法：体外培养内皮细胞ECV304，用3801xmol/L H2o2损伤细胞，随机分成正常组、模型组、血清对照组、丹参组、加减清营汤含药血清组。用血清药理学方法给药，继续培养后应用MIT法观察细胞存活率，检测SOD。结果表明：加减清营汤含药血清组MTT的OD值在24h点高于H202模型组(P0.05)，36h后与血清对照组有明显差异(P2O2对ECV。的损伤程度，其机理可能与抗氧化作用有关。
关键词：加减清营汤；血栓闭塞性脉管炎；H202；血管内皮细胞；MTT；SOD
中图分类号：R285.5
文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2008)01-0141-03
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血栓闭塞性脉管炎(TAO)属中医学“脱疽”范畴，是一种常见的周围血管疾病，其发病率居周围血管病的第2位，多见于青壮年男性。临床以加减清营汤治疗TAO的疗效已得到证实，实验研究亦观察到该方的作用机理与改善血液流变学状态、降低全血黏度和血浆黏度、抑制血小板聚集功能、改善血液循环状态有关。为深入探讨该方治疗TAO的机制，本实验采用体外细胞培养方法，用H2O2诱导血管内皮细胞损伤模型，研究加减清营汤对内皮细胞存活率和SOD活力的影响。现将结果报道如下。
1 实验材料
1.1 细胞药物及试剂人脐静脉血管内皮细胞株(EcV304)：购自中国科学院上海生物化学研究所，中国科学院典型培养物保藏委员会。加减清营汤：全方由丹参、赤芍、生地、金银花、连翘、毛冬青等组成，制成100%煎剂(即lmL/lg生药)，药物由本校国医堂门诊部药房提供，符合2005版药典要求。
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丹参注射液：江苏神龙药业有限公司生产，批号：0506143。RPIM-1640培养粉：GIBCO，USA，批号：2535081。小牛血清：杭州四季青生物工程材料研究所，批号：040603。胰蛋白酶：Typrin，1：250，Amerso，USA，批号：0428S05。四甲基偶氮唑盐：NTr，Bioshorp，批号：G793。二甲基亚砜：上海凌峰化学试剂有限公司，批号：050718。超氧化物歧化酶(sOD)测定试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号：20041221。30%过氧化氢：H2o2，分析纯，上海久忆化学试剂有限公司，批号20060910。
1.2 动物 SD雄性大鼠8只，体重(280±20)g，由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供，合格证号：SCXK2003-0003。
1.3 仪器5%Co2培养箱(NAPCO，USA)；倒置相差显微镜(Olympus，Japan)；酶联免疫检测仪(BIO-RAD，USA)。
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2 实验方法
2.1 药物血清的制备加减清营汤水煎剂以人临床用量×动物等效剂量比值×血清稀释度为参考浓度给给大鼠连续灌胃3天，每天2次，正常对照组给予等量蒸馏水。于末次给药后1h(灌药前禁食不禁水12h)，颈动脉取血。以1000r/min离心15mln，分离血清，然后56℃ 30mln灭活以除去补体，再用0.22ttm的微孔滤膜过滤除菌，密封后置于-20℃冰箱保存备用。
2.2 细胞培养用传代人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)作细胞培养，按照常规方法复苏，将收获细胞用培养液悬浮后，种植于培养瓶内，置37℃ 5%co2培养箱内培养2天，待细胞生长至80%融合时，用于实验。
2.3 分组与处理将呈对数生长期的ECv304以105/cm2的密度接种于96孔板，分为5组，待细胞长至融合后，除正常组外，其余各组在造模前均用不含血清的培养液以增强细胞对H2O2损伤的敏感性。即：(1)正常组。含10%小牛血清的培养液；(2)模型组：加H2O2(终浓度为380ttmol/L)、不含血清的培养液；(3)血清对照组：加H2O2(终浓度为380ttmol/L)、含10%正常大鼠血清的培养液；(4)丹参组：加H2 02(终浓度为380；tmol/L)、含10%丹参注射液(终浓度为0.5g/L)的培养液；(5)加减清营汤含药血清组：加H2O2(终浓度为380umol/L)、含10%加减清营汤药物血清的培养液；操作完成后，置于37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱中分别培养24、36h。 2.4 MTF法测定细胞活性往96孔板加入5mg/mL浓度的MTr,37℃培养4h。再加入100UL DMSO震荡15min，待细胞线粒体代谢MTT所形成的甲(月朁)充分溶解后，用酶联免疫检测仪按参比波长为490rim，测定各孔吸收OD值。
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2.5 SOD测定取各组细胞上清液100UL，按试剂盒方法进行操作。
2.6 统计处理计量资料用均数±标准差(X±S)表示。应用SPSS11.0软件进行统计学处理，采用多个样本均数间比较的方差分析和两两比较的q检验。a=0.05为显著性检验水准。
3 结果
见表1-2。
结果显示：模型组OD值明显低于其他各组，且差别有统计学意义(P0.05)，在36h OD值高于血清对照组，且差别有统计学意义(P0.05)外，与其他各组均有差别，且差别有统计学意义(P<0.01)；加减清营汤组SOD活性明显高于其他各组，且差别有统计学意义(P<0.01)。
4 讨论
血栓闭塞性脉管炎(TAO)属中医“脱疽”范畴，除了瘀血，营热、阴损也是其重要的病理因素，临床可见局部红肿破溃，痛如火灼，甚则毛发枯槁，肉腐筋烂，或局部皮肤干燥、脱屑、皲裂，汗毛脱落、稀疏或生长停止，趾(指)甲近增厚或薄脆变形、生长缓慢，肌肉萎缩，形体消瘦，舌绛脉细等, 百拇医药(王 敏 傅 雷 江励华 吴颢昕 何文彬)
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