疏肝和胃丸对大鼠胃黏膜组织EGFR蛋白表达的影响
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摘 要：目的：观察疏肝和胃丸对应激大鼠胃黏膜组织及血清EGFR蛋白表达的影响。探讨该方对胃黏膜的保护作用机制。方法：采用冷水一束缚应激性胃黏膜损伤大鼠模型，在预先给予疏肝和胃丸混悬液给动物灌胃7天后，观察胃黏膜组织及血清EGFR蛋白表迭的变化。结果：疏肝和胃丸能增加应激性胃黏膜损伤大鼠胃黏膜组织EGFR蛋白的表达。结论：疏肝和胃丸对应激性胃黏膜损伤大鼠胃黏膜保护作用机制可能与提高黏膜组织EGFR蛋白的表迭。促进胃黏膜上皮的新生修复有关。
关键词：疏肝和胃丸；应激性；胃黏膜损伤；EGFR
中图分类号：R285.5
文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2008)01-0201-02
1 材料和方法
1.1 动物 Wistar大鼠(180～220)g 40只，清洁级，雄性，由湖南中医药大学实验动物中心提供。
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1.2 药物和主要试剂 疏肝和胃丸干浸膏粉，每克含生药11.57g，由湖南中医药大学附属一院药剂科提供。雷尼替丁胶囊，0.15g/粒，杭州民生药业有限公司。SABC免疫组化染色试剂盒，兔抗EGFR多克隆抗体，武汉博士德生物工程有限公司。
1. 3动物造模方法参照文献[1]介绍的造模方法，采用水浸束缚应激(WRS)制作应激性溃疡模型。各组动物于造模前禁食不禁水24h，将大鼠束缚于固定器竖立浸入(20±1)℃的恒温水箱中，水面齐大鼠剑突水平，持续10h后取出动物。
1.4 给药方法 造模前疏肝组每只动物经体表面积换算后将疏肝和胃丸按1.08g/(Kg·d)溶于2mL生理盐水中灌胃(相当正常人体剂量的2倍)，每日1次，连续7天。雷尼组每只动物经体表面积换算后将雷尼替丁按0.0015g/(kg·d)溶于2mL生理盐水中灌胃(相当正常人体剂量的1倍)，每日1次，连续7天。正常组、模型组2mL生理盐水灌胃，每日1次，连续7天。
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1.5 取材方法 取新鲜胃黏膜2小块(每小块约5mm×5mm)，4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、间断连续切片，切片厚为4μm。
1.6 免疫组化染色步骤 ①胃黏膜组织石蜡切片捞片60℃烤片60min；②脱蜡；③3%过氧化氢水灭活内源性酶；④微波修复抗原；⑤滴加抗原修复液；⑥滴加正常山羊血清封闭液；⑦滴加兔抗EGFR的一抗(1：100稀释)；⑧滴加生物素化二抗(山羊抗兔IgG)；⑨滴加试剂SABC；⑩加显色剂混匀；⑾显色；⑿苏木素轻度复染；⒀封片。
1.7 结果判定方法 以细胞膜和细胞浆内出现棕黄色颗粒为判定标准，用MIAS医学图象分析系统在电脑上对每张图片进行扫描，以扫描结果中的阳性细胞率和平均灰度值为测定指标。
1.8 对照试验方法空白对照：用PBS替代EGFR——进行上述免疫组化反应，是阴性对照中最常用的一种。若阴性对照出现阳性结果，说明实验组的阳性结果是假的。替代对照：用正常山羊血清替代c-los-抗进行上述免疫组化反应。
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2 结果与分析
EGFR阳性细胞染色位于胞膜和胞浆，显色由棕黄至棕褐色，分别表示阳性表达由弱至强。实验所见正常组胃黏膜上皮细胞有EGFR!阳性表达，阳性细胞主要位于胃黏膜顶端和胃小凹的柱状上皮细胞层，染色较浅，固有层基底部也有少量阳性细胞，见图1。模型组可见受损胃黏膜局部有EGFR阳性细胞聚集，细胞染色也较深，见图2。
雷尼组则可见胃黏膜上皮和胃小凹有大量EGFR阳性细胞，星强阳性反应，固有层基底部的阳性细胞也显著增加，见图3。疏肝组在胃黏膜增殖带和固有层基底部有较强性表达，见图4。
统计结果，显示正常组胃黏膜组织EGFR阳性细胞率及平均灰度值和模型组比较无差异(P>0.05)；疏肝组、雷尼组的胃黏膜组织EGFR阳性细胞率及平均灰度值明显高于模型组与正常组(P<0.01)；疏肝组的胃黏膜组织EGFR阳性细胞率及平均灰度值明显高于雷尼+模型组(P<0.05)，结果详见表l。
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结果表明：疏肝和胃丸能增加应激性胃黏膜损伤大鼠胃黏膜组织EGFR蛋白的表达。且作用优于雷尼替丁。
3 讨论
EGFR是一带有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白。是EGF、TGFa的共同受体。EGFR广泛存在于胃肠黏膜上皮层，平均每个上皮细胞约5000—10000个受体，见于胞膜和胞浆，以胞膜为主，其在应激所致胃肠道损伤后的修复过程中，不仅传递EGF家族的生物学活性而且倡导它们的完全表达，同时可提高损伤部位附近EGFR数目，从而促进黏膜上皮损伤的修复。两者与EGFR结合并激活后，作为自分泌或旁分泌生长因子诱导后者磷酸化，提供持续分裂信号到细胞内，引起细胞增殖、分化，能将相应配体EGF、TGFa的生物活性跨胰传递至胞内，从而激活与EGF、TGFa生物效应有关的胞内级联反应。这些反应可分为早期反应和激活与EGF、TGFa生物效应有关的胞内级联的反应。这些反应可分为早期反应和迟发反应。早期反应包括黏液分泌增加、细胞内骨架结构的改变以及胃黏膜上皮细胞移行活跃，早期反应常在EGF作用后几分钟就能发生，启动细胞增殖则属于迟于效应之一。
在采用免疫组化检测EGFR受体蛋白结果中，可见经疏肝和胃丸灌胃7天后，疏肝+模型组与模型组比较能显著提高胃黏膜中的EGFR蛋白表达，其作用优于雷尼替丁。说明增加胃黏膜EGFR表达可能是疏肝和胃丸胃黏膜保护作用的重要机制。, 百拇医药(林 辉)