三七总皂苷对糖尿病大鼠肾脏结缔组织生长因子表达的影响(2)
糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常见而严重的并发症，是导致终末期肾病的常见原因。DN的基本病理改变为肾脏肥大、肾小球基底膜增厚和系膜基质进行性积聚，最终导致肾小球硬化和肾间质纤维化。其发病机制尚未完全明了，其中细胞因子、生长因子和肾素-血管紧张素系统起着重要作用。研究证明结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)的表达增高对DN的进程有重要影响，降低CTGF的表达对DN的防治具有重要意义。临床研究表明中药三七对DN有着良好的疗效，本实验拟通过观察三七总皂苷对糖尿病大鼠肾脏CTGF基因表达的影响和对肾脏的保护作用，以探讨三七总皂苷防治DN的可能作用机制。
1材料与方法
1.1实验动物
清洁级3月龄SD大鼠35只，雄性，体重150～200g，浙江省医学科学院实验动物中心提供。大鼠饲养于清洁级动物室，室温21～25℃。1.2试剂
, 百拇医药
链脲佐菌素(STZ)、氨基胍(AG)为美国Sigma公司产品，血栓通胶囊(每粒含三七总皂苷100mg)为黑龙江珍宝岛制药有限公司产品。血糖测定试剂盒由上海丰汇医学科技有限公司提供，尿蛋白测定试剂盒由南京建成生物工程公司提供；总RNA抽提试剂Trizol、逆转录酶试剂盒、Taq DNA聚合酶由上海生工生物工程技术服务有限公司提供。DNA梯度 Marker由Takara公司提供。
1.3引物
搜索GenBank数据库大鼠CTGF mRNA序列，利用Primer Premier引物设计与分析软件设计CTGF及内参GAPDH引物，委托上海生工生物工程公司合成，序列如下：CTGF引物：上游：5’-GGCCCTGCCCTAGCTGCCTA-3’，下游：5’-TGGAGATGCCCATCCCACAG-3’，目标长度：130bp；GAPDH引物：上游：5’-GTCGGTGTGAACGGATTT-3’，下游：5’-ACTCCACGACGTACTCAGC-3’，目标长度：276bp。
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1.4方法与步骤
1.4.1造模 分组及治疗 适应性饲养大鼠1周。造模前将所有大鼠随机分为正常对照组(NC组，6只)和糖尿病造模组(29只)。STZ临用前用0.1mol/L无菌枸橼酸钠缓冲液(pH4.4)配成2%的溶液，放于冰浴中。造模大鼠禁食不禁水14h，将STZ以65mg/kg一次性于大鼠左下腹腔注射造模，2h后给大鼠进食。正常对照组按相同的方法和剂量注射枸橼酸钠溶液。72h后连续3天尾静脉检测血糖(Glucose Glu)。以连续3次血糖>16.65mmol/L，尿量>原尿量150%，饮水明显增多者为大鼠糖尿病成模标准[1-2]。造模后选取符合成模标准，状态稳定的糖尿病大鼠(共24只)，随机分为糖尿病模型组(DM组，8只)，三七总皂苷组(PNS组，8只)和氨基胍组(AG组，8只，在实验过程中死掉1只)，并予药物进行干预。其中，PNS组给予三七总皂苷100mg•kg–1•d–1灌胃，AG组给予氨基胍100mg•kg–1•d–1灌胃，DM组及NC组给予生理盐水1mL•100g–1•d–1灌胃。共8周。
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1.4.2标本收集与处理 第8周末于处死大鼠前1天，用代谢笼收集24h尿标本，记录尿量后取5mL保存于-20℃冰箱中待测；大鼠称重后，从股静脉采血，分离血清待测；随后处死大鼠，取双肾，去掉肾包膜称重，右肾用10%中性福尔马林溶液固定，行PAS染色，左肾液氮冷冻，-70℃冰箱冻存，用于提取总RNA。
1.4.3指标检测采用日立-7020型全自动生化分析仪检测血糖，用考马斯亮兰法检测尿蛋白，并计算24h尿蛋白定量。
1.4.4肾组织病理学检查 取适量右肾组织行石蜡包埋，制成厚度为3μm切片，行PAS染色，光镜下观察大鼠肾脏病理变化。用多功能彩色病理图像分析系统在200倍下进行病理分析。每个切片随机选择10个正切的肾小球，测定肾小球平均截面积(MeanGlomerular Area, MGA)，取其平均值作为每个标本的MGA，并根据公式肾小球平均体积(Mean Glomerular Volume, MGV)=1.25×(MGA)3/2计算MGV。
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1.4.5肾皮质CTGFmRNA的检测 分别取各组大鼠肾皮质100mg，按Trizol试剂说明书操作，提取总RNA。所得RNA，用紫外分光光度计测260nm/280nm处的紫外吸收值(OD值)，每个样品重复测3次，结果：所提取的RNAA260/280比值约在1.8～2.0。将所提取的总RNA经1%的琼脂糖凝胶电泳显示5s、18s和28s三条带，证实RNA无降解。
取3μLRNA样品，1μL Oligo(dT)18加入一无RNA酶的200μL薄壁PCR管中，用灭活DEPC水补足至10μL，混匀。65℃加热变性10min，迅速冰水浴0.5min，37℃3 min。按下列顺序加入：5×Buffer 4μL，dNTP(10mM)1μL，RNA酶抑制剂0.5μL，M-MLV逆转录酶(200U/μL)0.8μL，DEPC水最终补足至20μL混匀，42℃反应1h，然后95℃10min以灭活逆转录酶，短暂离心，-20℃冻存。
取上述逆转录反应产物10μL行PCR，按下列步骤操作(30μL反应体系):cDNA10μL，10×Buffer2.5μL，MgCl2(25Mm)2μL，dNTP(10mM)0.5μL，CTGF引物正、负引物各0.5μL，DEPC-H2O 13.8μL，Taq DNA酶0.2μL，将上述各成分混匀，先94℃变性3min，然后94℃变性15s、60℃退火30s、72℃延伸30s，进行30个循环扩增，最后72℃延伸5min。PCR产物-20℃冻存。
, http://www.100md.com
GAPDH的PCR扩增按下列步骤操作(30μL反应体系):cDNA3μL，10×Buffer3μL，MgCl2(25Mm)1.8μL，dNTP(10mM)0.6μL，GAPDH引物正、负引物各0.5μL，DEPC- H2O 20.1μL，TaqDNA酶0.5μL，将上述各成分混匀，先94℃变性3min，然后94℃变性15s、60℃退火30s、72℃延伸30s，进行30个循环扩增，最后72℃延伸5min。PCR产物-20℃冻存。
取8μL PCR产物与2μL上样液混合，以2%琼脂糖(含溴化乙锭 0.5g/mL)，在1×TAE缓冲液中，电压80V的条件下电泳，电泳结果在紫外灯下观察，以GAPDH为内参照，用凝胶扫描成像系统对产物进行半定量分析，结果以CTGF与对应的GAPDH密度积分比值表示CTGFmRNA相对表达量。
1.4.6统计学处理 所有数据均以均数±标准差表示，样本均数组间的比较用One-WayANOVA(单因素方差分析)方法，方差齐性用Student-Newman-Keuls检验，方差不齐用Tamhane's T2检验。P<0.05，P<0.01表示有统计学意义。上述统计过程均采用SPSS11.5统计软件进行分析。, http://www.100md.com(傅珍春 徐 刚 葛婷爱 江婷婷 袁赤亭)
1材料与方法
1.1实验动物
清洁级3月龄SD大鼠35只，雄性，体重150～200g，浙江省医学科学院实验动物中心提供。大鼠饲养于清洁级动物室，室温21～25℃。1.2试剂
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链脲佐菌素(STZ)、氨基胍(AG)为美国Sigma公司产品，血栓通胶囊(每粒含三七总皂苷100mg)为黑龙江珍宝岛制药有限公司产品。血糖测定试剂盒由上海丰汇医学科技有限公司提供，尿蛋白测定试剂盒由南京建成生物工程公司提供；总RNA抽提试剂Trizol、逆转录酶试剂盒、Taq DNA聚合酶由上海生工生物工程技术服务有限公司提供。DNA梯度 Marker由Takara公司提供。
1.3引物
搜索GenBank数据库大鼠CTGF mRNA序列，利用Primer Premier引物设计与分析软件设计CTGF及内参GAPDH引物，委托上海生工生物工程公司合成，序列如下：CTGF引物：上游：5’-GGCCCTGCCCTAGCTGCCTA-3’，下游：5’-TGGAGATGCCCATCCCACAG-3’，目标长度：130bp；GAPDH引物：上游：5’-GTCGGTGTGAACGGATTT-3’，下游：5’-ACTCCACGACGTACTCAGC-3’，目标长度：276bp。
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1.4方法与步骤
1.4.1造模 分组及治疗 适应性饲养大鼠1周。造模前将所有大鼠随机分为正常对照组(NC组，6只)和糖尿病造模组(29只)。STZ临用前用0.1mol/L无菌枸橼酸钠缓冲液(pH4.4)配成2%的溶液，放于冰浴中。造模大鼠禁食不禁水14h，将STZ以65mg/kg一次性于大鼠左下腹腔注射造模，2h后给大鼠进食。正常对照组按相同的方法和剂量注射枸橼酸钠溶液。72h后连续3天尾静脉检测血糖(Glucose Glu)。以连续3次血糖>16.65mmol/L，尿量>原尿量150%，饮水明显增多者为大鼠糖尿病成模标准[1-2]。造模后选取符合成模标准，状态稳定的糖尿病大鼠(共24只)，随机分为糖尿病模型组(DM组，8只)，三七总皂苷组(PNS组，8只)和氨基胍组(AG组，8只，在实验过程中死掉1只)，并予药物进行干预。其中，PNS组给予三七总皂苷100mg•kg–1•d–1灌胃，AG组给予氨基胍100mg•kg–1•d–1灌胃，DM组及NC组给予生理盐水1mL•100g–1•d–1灌胃。共8周。
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1.4.2标本收集与处理 第8周末于处死大鼠前1天，用代谢笼收集24h尿标本，记录尿量后取5mL保存于-20℃冰箱中待测；大鼠称重后，从股静脉采血，分离血清待测；随后处死大鼠，取双肾，去掉肾包膜称重，右肾用10%中性福尔马林溶液固定，行PAS染色，左肾液氮冷冻，-70℃冰箱冻存，用于提取总RNA。
1.4.3指标检测采用日立-7020型全自动生化分析仪检测血糖，用考马斯亮兰法检测尿蛋白，并计算24h尿蛋白定量。
1.4.4肾组织病理学检查 取适量右肾组织行石蜡包埋，制成厚度为3μm切片，行PAS染色，光镜下观察大鼠肾脏病理变化。用多功能彩色病理图像分析系统在200倍下进行病理分析。每个切片随机选择10个正切的肾小球，测定肾小球平均截面积(MeanGlomerular Area, MGA)，取其平均值作为每个标本的MGA，并根据公式肾小球平均体积(Mean Glomerular Volume, MGV)=1.25×(MGA)3/2计算MGV。
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1.4.5肾皮质CTGFmRNA的检测 分别取各组大鼠肾皮质100mg，按Trizol试剂说明书操作，提取总RNA。所得RNA，用紫外分光光度计测260nm/280nm处的紫外吸收值(OD值)，每个样品重复测3次，结果：所提取的RNAA260/280比值约在1.8～2.0。将所提取的总RNA经1%的琼脂糖凝胶电泳显示5s、18s和28s三条带，证实RNA无降解。
取3μLRNA样品，1μL Oligo(dT)18加入一无RNA酶的200μL薄壁PCR管中，用灭活DEPC水补足至10μL，混匀。65℃加热变性10min，迅速冰水浴0.5min，37℃3 min。按下列顺序加入：5×Buffer 4μL，dNTP(10mM)1μL，RNA酶抑制剂0.5μL，M-MLV逆转录酶(200U/μL)0.8μL，DEPC水最终补足至20μL混匀，42℃反应1h，然后95℃10min以灭活逆转录酶，短暂离心，-20℃冻存。
取上述逆转录反应产物10μL行PCR，按下列步骤操作(30μL反应体系):cDNA10μL，10×Buffer2.5μL，MgCl2(25Mm)2μL，dNTP(10mM)0.5μL，CTGF引物正、负引物各0.5μL，DEPC-H2O 13.8μL，Taq DNA酶0.2μL，将上述各成分混匀，先94℃变性3min，然后94℃变性15s、60℃退火30s、72℃延伸30s，进行30个循环扩增，最后72℃延伸5min。PCR产物-20℃冻存。
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GAPDH的PCR扩增按下列步骤操作(30μL反应体系):cDNA3μL，10×Buffer3μL，MgCl2(25Mm)1.8μL，dNTP(10mM)0.6μL，GAPDH引物正、负引物各0.5μL，DEPC- H2O 20.1μL，TaqDNA酶0.5μL，将上述各成分混匀，先94℃变性3min，然后94℃变性15s、60℃退火30s、72℃延伸30s，进行30个循环扩增，最后72℃延伸5min。PCR产物-20℃冻存。
取8μL PCR产物与2μL上样液混合，以2%琼脂糖(含溴化乙锭 0.5g/mL)，在1×TAE缓冲液中，电压80V的条件下电泳，电泳结果在紫外灯下观察，以GAPDH为内参照，用凝胶扫描成像系统对产物进行半定量分析，结果以CTGF与对应的GAPDH密度积分比值表示CTGFmRNA相对表达量。
1.4.6统计学处理 所有数据均以均数±标准差表示，样本均数组间的比较用One-WayANOVA(单因素方差分析)方法，方差齐性用Student-Newman-Keuls检验，方差不齐用Tamhane's T2检验。P<0.05，P<0.01表示有统计学意义。上述统计过程均采用SPSS11.5统计软件进行分析。, http://www.100md.com(傅珍春 徐 刚 葛婷爱 江婷婷 袁赤亭)