三七总皂苷对阿霉素肾病大鼠肾组织CTGF蛋白及其mRNA表达的影响(2)
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1.4观察指标与方法
1.4.1尿蛋白定量分析
采用考马斯亮蓝法，每隔1周进行大鼠24h尿蛋白量测定一次。
1.4.2血液生化指标测定
用药第10周周末，进行大鼠颈动脉取血，分离血清，测血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)。
1.4.3免疫组化方法
主要步骤如下：切片脱蜡；0.01%曲拉通15min；3%H2O2-甲醇10min；微波修复90~98℃15min；复合消化液4℃10min；滴加一抗(1:100)4℃过夜；DAB显色；梯度脱水封片。阴性对照，一抗用PBS代替。
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1.4.4原位杂交方法
大鼠CTGFmRNA寡核苷酸探针序列：3’-ATTTTCCTTT AGAGGAAACT GGATCATTTA AAGGGCATCA-5’，3’-TTCACCTCGGAGTTCACAAA GCAAATGCTC TTGTTTAAAC-5’。
主要步骤如下：石蜡切片脱蜡；0.01%曲拉通15min；3%H2O2-醇10min；复合消化液15min；预杂交液37℃2h；杂交液37℃3h；2×SSC10min；1×SSC15min；0.1×SSC15min；封闭液15min；地高辛4℃过夜；SABC 37℃40min；DAB显色37℃15min；苏木素复染25s；梯度脱水封片。阴性对照，杂交液用0.01M PBS代替。
1.4.5肾组织图像分析
使用ICMIAS系列多功能图像分析系统对肾组织CTGF蛋白及其mRNA结果进行分析，按每组大鼠随机选取5个视野对肾组织的病变情况进行灰度分析，然后进行统计学处理。
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1.5统计学处理方法
所有数据以SPSS 11.0统计软件进行统计学处理，结果表示为±s，用方差分析法进行组间比较。
2结果
2.1一般状态
除正常组和假手术组大鼠外，其余各组大鼠均有不同程度的摄食减少，精神不振，活动迟缓，饮水量减少，尿量减少，体重减少，体毛缺乏光泽，并且模型组大鼠出现腹水等。治疗组以上情况得到不同程度的改善，其中以三七总皂苷组大鼠一般情况最好。
2.2 三七总皂苷对ADR肾病大鼠体重的影响
从表1可以看出，模型组大鼠体重在不同时间段，和正常组与假手术组比较，大鼠体重明显减轻，均有显著性差异。而苯那普利组、三七总皂苷组，在第8周、第10周，分别与模型组比较，大鼠体重明显增加，P<0.05或P<0.01，均有显著性差异，三七总皂苷组与苯那普利组比较，没有显著性差异。
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2.3三七总皂苷对肾脏病理的影响
光学显微镜观察，正常组和假手术组可见正常结构肾小球及肾小管。模型组肾小球系膜细胞增生，肾小球系膜区增宽，球囊壁粘连。病变肾小球周围的近曲小管上皮细胞肿胀，肾小管萎缩，肾小管腔内可见蛋白管型。肾小管炎性细胞浸润、肾间质纤维化。苯那普利组肾小球系膜区中度增宽，球囊粘连较少。近曲小管上皮细胞变性，肾间质炎性细胞浸润。三七总皂苷组肾小球系膜细胞轻度增生，肾小球系膜区轻度增宽。有少量肾间质炎性细胞浸润。
2.4三七总皂苷对ADR肾病大鼠24h尿蛋白定量的影响
从表2可以看出，模型组大鼠24h尿蛋白定量，从第2周开始明显升高，与正常组和假手术组比较有显著性差异。随时间推移，模型组大鼠24h尿蛋白定量逐渐增加，呈现大量蛋白尿。而治疗组大鼠，从第2周开始，尿蛋白排泄即不同程度减低，第6周三七总皂苷组，与模型组比较，P<0.05，三七总皂苷与苯那普利组比较，没有显著性差异。
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2.5 三七总皂苷对ADR肾病大鼠ChoTGBUNScrTP和Alb的影响
从表3可以看出，模型组ADR肾病大鼠存在着脂质代谢紊乱、低蛋白血症和肾功能损害。与模型组比较，苯那普利组、三七总皂苷组，可以明显纠正脂质代谢紊乱，P<0.05；可以明显提高Alb和TP的水平，P<0.05；可以明显改善肾功能，降低BUN和Ser，P<0.05。三七总皂苷与苯那普利组比较，没有显著性差异。
2.6三七总皂苷对阿霉素肾病大鼠肾组织CTGF及其mRNA的影响
正常组及假手术组肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞
及肾间质细胞胞浆中有较弱的CTGF及其mRNA表达；模型组与正常组和假手术组相比较，肾小管上皮细胞和肾间质细胞中CTGF及其mRNA表达在核周呈强阳性表达，也有一些肾小球系膜细胞胞浆内CTGF及其mRNA表达上调；苯那普利组和三七总皂苷组CTGF及其mRNA的表达与模型组相比显著减弱，且二者间无显著差异(见表4)。
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3讨论
阿霉素肾病是一经典的实验性肾病模型，ADR在体内药物代谢酶的作用下，形成半醌自由基，半醌自由基与氧化反应生成超氧阴离子和羟自由基，二者可通过膜的脂质过氧化作用，对肾脏造成损伤[3-4]。本研究采用加强型，即单侧肾切除合并阿霉素腹腔注射的造模方法，实验操作简便，且从各项生化指标和肾组织形态学改变情况看，造模效果良好。
生理状态时，肾小球壁层和脏层上皮细胞、肾间质成纤维细胞、肾小管上皮细胞和管周毛细血管内皮细胞均可分泌少量CTGF[5]。在一些病理状态下，特别是在伴有细胞增生和ECM合成的肾小球系膜和小管间质病变区，CTGF表达量明显增加。CTGF可以促进间质成纤维细胞，肾小球系膜细胞从G0期进入G1期，但阻止细胞从G1期过渡到S期，且对成纤维细胞有强烈的趋化作用，从而导致系膜区细胞增殖和成纤维细胞积聚[6]。它可以刺激NRK细胞增生，并显著上调其表达Ⅰ型胶原、FN和α5整合素mRNA的表达。Gore-Hyer等经研究发现，CTGF和TGF-β均可明显诱导人肾小球系膜细胞(HMCs)胶原的表达，且作用强度相似。另外，TGF-β和CTGF可诱导HMCs的α2(1)-胶原启动子活性和mRNA，水平相似[7]。
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作为TGF-β的下游因子，在纤维化过程中，CTGF可以由于受到TGF-β的刺激而增加表达。研究表明，在放线菌酮存在的条件下TGF-β的诱导作用可被加强，这说明该诱导过程并不需要蛋白从头合成，TGF-β可直接刺激CTGF基因转录。众所周知，在组织纤维化过程中TGF-β是一把“双刃剑”，其负面效应主要由CTGF途径介导完成，而正面效应则由非CTGF途径介导[8]。且CTGF仅仅阻断TGF-β的致纤维化作用，并不影响TGF-β的抗细胞增殖和抗炎症效应[9]。因此，CTGF可能为防治肾纤维化提供了一个新的、更安全的治疗靶点。我们可以尝试通过抑制CTGF表达来遏制TGF-β的负面作用，从而控制纤维化的进程。
三七总皂苷具有扩张血管，降低心肌耗氧量，抑制血小板凝集，延长凝血时间，降血脂，清除自由基，抗炎，抗氧化等药理作用。近年来随着对其研究的不断深入，又发现了许多新的药理作用和临床用途。Su等通过实验发现PNS能够延缓UUO大鼠肾间质纤维化的进程[10]，韦颖等[11]从细胞水平研究，发现PNS在最佳浓度范围和作用时间内明显抑制KFB细胞增殖及分泌Ⅰ型胶原，同时显著降低KFB上整合素β1的表达，提示PNS可成为防治肾间质纤维化的有效药物。刘海燕等[12]研究也表明PNS剂量依赖性地抑制尿毒血清诱导的肾小管上皮细胞增殖和总胶原的分泌，从而延缓肾小管间质纤维化进程，改善肾功能。其他学者[10，13-14]研究证实三七总皂苷可通过阻断IL-1α诱导的肾小管上皮细胞转分化及减少细胞外基质分泌，防治肾间质纤维化的发生；对单侧输尿管梗阻后的肾间质纤维化有抑制作用，可阻断肾小管上皮细胞-肌纤维母细胞的转分化；同时对DN具有一定的消除尿蛋白作用，有良好的临床治疗效果。本实验研究结果显示，三七总皂苷可以明显改善ADR肾病大鼠摄食，精神状态，增加尿量和体重减少等一般状态。可以明显减少ADR肾病大鼠尿蛋白的排泄、调节其血脂异常、降低BUN和Scr改善肾功能，明显减轻肾脏的组织病理损害，从而起到对肾脏的保护作用，其确切机理可能是通过下调CTGF及其mRNA的表达而减轻肾纤维化的病程进展。, http://www.100md.com(仇 琪 赵宗江 杨美娟)