葛根素对两肾一夹高血压大鼠左心室Apekin/APJ基因表达的影响(2)
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左室肥厚(LVH)是与死亡、心血管事件相关的独立危险因素[1]，是典型的高血压心脏表现，其中血管活性物质起到重要的作用。Apelin是新近发现的小分子活性多肽[2]，与AngⅡ具有同源性，属于RAS体系的新成员[3]。Apelin对正常与病变心脏都具有正性肌力、舒张血管、降低血压的心血管保护作用[4]，其受体为G蛋白偶联受体(血管紧张素受体AT-1相关的受体蛋白，APJ)。Apelin及其受体APJ的mRNA及蛋白广泛存在于哺乳动物与人的多种组织(脑、肺、心脏、血管等)中[5]。葛根素( puerarin) 是单体-异黄酮化合物，已广泛应用于心脑血管及肺等疾病的治疗。笔者先前的研究发现葛根素有逆转肾性高血压大鼠左室肥厚的作用，但机制尚未完全明了。本研究在两肾一夹肾性高血压大鼠模型上，观察葛根素对Apelin及其受体APJ的影响，旨在进一步探讨葛根素对高血压左室肥厚的影响及其机制，为拓展其临床新用途提供实验依据与理论基础。
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1材料与方法
1.1 材料健康雄性SD大鼠30只，体重150～180g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供；葛根素注射液由浙江康恩贝制药股份有限公司提供，批号060103；Trizol购自GIBCO BRL.(USA)；dNTP购自Clontech CO.(USA)，M-MuLV逆转录酶、Taq酶、RNAsin和Oligo(dT)15 Primer为上海晶美生物技术有限公司。余为市售分析纯产品。4个PCR引物由赛百盛公司合成(见表1)。
1.2 两肾一夹高血压模型的复制[6]及处理30只雄性SD大鼠随机均分为正常组(C)、模型组(M)和葛根素组(P)。后两组大鼠，术前禁食过夜，自由饮水，用戊巴比妥钠(35mg•kg-1,腹腔注射)麻醉，上腹部正中切口，沿腹白线逐层分离，暴露肾脏及肾动静脉，玻璃分针分离动静脉，用银夹将肾动脉套住，并打结固定，术后正常进食与喂水。
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饲养8周后，C组和M组大鼠每天腹腔注射生理盐水(80mg•kg-1)，P组注射腹腔注射葛根素注射液(80mg•kg-1)。正常饲养4周后，麻醉，称重，左颈总动脉插管连接8通道生理记录仪(PowerLab系统，澳大利亚)记录平均颈动脉压(mCAP)及、LVEDP及(LV±dp/dtmax)，并计算LVM与大鼠体重(BW)的重量比，作为左室肥厚的指标。取左心室组织约50mg提取RNA，用于测定Apelin-36 mRNA及APJ mRNA水平。
1.3 左心室总RNA的提取及半定量RT-PCR测定Apelin-36及APJ mRNA水平用Trizol一步法提取总RNA。M-MuLV逆转录酶及Oligo(dT)15 primer逆转录成单链cDNA。测定Apelin-36 mRNA以及β-actin含量的PCR反应总体积为25μL：cDNA 2μL，上下游引物共1μL,Taq DNA聚合酶混合物12μL,DEPC水10μL；反应条件：Apelin：95℃5min；94℃30s，61℃30s，72℃40s，热循环36次；72 ℃5min。β-actin：94℃30s，55℃30s，72℃40s，热循环24 次；72℃5min。PCR产物经琼脂糖电泳,凝胶成像及定量扫描仪分析，分别获得190bp和291bp的条带。Apelin-36 mRNA与β-actin mRNA的比值即为Apelin-36 mRNA的相对含量。重复3次独立试验。APJ mRNA含量的测定与Apelin36 mRNA含量的测定相似，PCR反应条件见表1。
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1.4 统计学处理方法结果以±s表示，利用SPSS11.0统计学软件进行单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1葛根素对2K1C肾性高血压大鼠mCAP LVEDP LV±dp/dt以及LVM/BW的影响 与C组相比，M组大鼠mCAP、LVEDP和LVM/BW分别升高36.58%(P<0.05)、333.8%(P<0.01)和20.24(P<0.01)，而LV+dp/dtmax则降低85.35%(P<0.05)。两组大鼠LV -dp/dtmax差异无统计学意义。
与M组相比，P组大鼠LVEDP、LV -dp/dtmax和LVM/BW分别降低65.24%(P<0.05)、96.28% (P<0.01)和13.12%(P<0.05)，LV+dp/dtmax则升高179.18%(P<0.01)。两组大鼠mCAP差异无统计学意义(表2)。
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2.2 左心室Apelin mRNA与APJ mRNA表达的变化 与C组相比，M组左心室组织ApclinmRNA、APJ mRNA表达分别增高77.66%和119.00% (均P<0.05)。
与M组相比，P组左心室组织ApclinmRNA、APJ mRNA表达分别降低了27.40%和45.66%(均P<0.05)，见图1～2。
3讨论
高血压是常见的心血管疾病，我国高血压患者已逾1.6亿，其中并发LVH约占1/3。LVH是由于心肌实质细胞肥大，间质增生和血管重构，心室僵硬度的增加，其特征是心室的重量、容量和横径增加，破坏了心脏结构的平衡，导致左室顺应性和舒张功能降低，冠脉储备减少，加重心肌缺氧。葛根素系豆科植物野葛干燥根中的提取物，其主要成分为8-D-吡喃葡萄糖-4, 7-二羟基异黄酮苷, 具有扩张冠状动脉、改善微循环、清除氧自由基、抑制平滑肌细胞增生等作用[7]。本研究前期研究表明，葛根素能有效改善肾性高血压大鼠的左室收缩舒张心功能以及左心室肥大的程度，但具体机制尚不清楚。
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本实验建立的两肾一夹(2K1C)高血压大鼠模型，是经典的肾素依赖性高血压动物模型，认为造成的肾动脉机械性狭窄导致体内肾素-血管紧张素系统(RAS)被异常激活，AngⅡ的表达明显增多，而AngⅡ是导致心肌向心性肥大的强刺激因素之一。有研究发现[2]，apelin及其受体APJ mRNA在心脏有高水平表达。Szokodi等[8]研究发现，离体的大鼠心脏中注入apelin (0.01～10nmol/L)可诱导心脏的正性肌力作用且呈剂量依赖性。在异丙肾上腺素所致的大鼠左心室肥大组织中apelin的蛋白表达减少，外源性给予apelin可减轻左心室肥大的程度[9]。
本研究发现肾性高血压大鼠左心室组织中apelin和APJ基因表达显著上调。由此可见,apelinAPJ信号系统在循环稳态调控中有着十分重要的作用，对高血压左心室代偿性肥厚的病理生理过程中具有保护作用。另有研究报道[10]，Apelin基因水平在心衰早期(NYHA1级)血浆中明显上升，中期(NYHA 2级)上升更高，而到晚期(NYHA 3、4级)则降低。可以推测，本实验模型组大鼠左心功能可能处于代偿期，通过apelin的正性肌力作用而抵抗AngⅡ所引起的后负荷升高的效应，改善左心功能。而葛根素组上述指标比模型组均明显降低，这可能是葛根素逆转左室肥厚发生发展的机制之一，而其作用机制是否与葛根素的扩张冠状动脉、改善微循环、清除氧自由基、抑制平滑肌细胞增生等药理作用有关，具体机制尚有待研究。另江志平等[11]发现葛根素可能通过降低血浆ET表达，提高NO水平来逆转高血压患者的左室重构，与本实验结果一致。, 百拇医药(金 戈 杨鹏麟 龚永生 范小芳 庄 红)