化瘀通络方对局灶性脑缺血大鼠再灌注(MCAO)后脑组织中HIF-1α及VEGF表达的影响(1)
摘 要：目的：探讨化瘀通络方对局灶性脑缺血大鼠再灌注(MCAO)后脑组织血管内皮生长因子(VEGF)及缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的影响。方法： 制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，给予化瘀通络方治疗后，用免疫组化法检测各组脑组织中VEGF及HIF-1α的表达。结果：化瘀通络方可显著减少MCAO大鼠VEGF和HIF-1α阳性细胞数量，降低脑组织中VEGF及HIF-1α的表达较(P<0.05,P<0.01)。结论：化瘀通络方对脑缺血损伤的保护作用与降低VEGF和c-fos表达有关。
关键词：化瘀通络方；MCAO；缺氧诱导因子-1α；血管内皮生长因子
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2011)04-0682-03
缺血性脑卒中(Ischemic Cerebral Stroke, ICS)，中医又称缺血性脑中风，是一种突然起病的脑部血液循环障碍性疾病。祖国医学将其列为“风、痨、臌、膈”四大疑难病之首。根据WHO公布的有关数据显示，世界范围内ICS的发病率为150～200人/10万人口。而在我国，60岁以上老年人ICS发病率高达30%～45%，幸存者中约50%留有不同程度的后遗症，且复发率高达40%～60%。对于脑卒中的治疗，药物方面提出了不少新理论和新方法，如抗凝、降纤、溶栓、钙离子拮抗剂、脑保护剂等，然而至今仍然未能取得突破性成果。我院神经内科经过多年的临床实践以化瘀通络法组方用于缺血性脑中风患者的治疗确切疗效【sup】[1]【/sup】。本研究建立MCAO动物模型，探讨化瘀通络方对局灶性脑缺血大鼠再灌注(MCAO)后的作用。以阐明化瘀通络方防治急性缺血性脑卒中的可能作用靶点。
, 百拇医药
1 实验材料
1.1 实验药品
化瘀通络方由葛根、当归、补骨脂、制大黄、水蛭等组成，由江阴天江药业有限公司提供，批号：0910119；脑血康胶囊，山东昊福制药有限公司，批号：20100202；青霉素，山东鲁抗医药股份有限公司，批号：B091107；戊巴比妥钠，中国医药上海化学试剂公司，批号：F20091216Rabbit Anti-rat，HIF-1αAntbody：Rabbit AntVEGF；Antbody:即用型快速免疫组化MaxVision【sup】TM【/sup】试剂盒：福州迈新生物公司提供(KIT-5030)。DAB显色试剂等均由福州迈新生物公司提供。
1.2 实验动物和实验用饲料
SD大鼠，雄性，280～320g，由浙江大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(浙)2008-0033，实验用饲料由江苏省协同医药生物技术有限公司提供，批号20100325。
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1.3 实验用仪器
电子分析天平FA10047南京市计量测试所，80-2台式低速离心机，上海医疗器械有限公司手术器械厂，TP 1020自动脱水机：德国LEICA公司产品。RM2135型石蜡切片机：德国LEICA公司产品。 CS-VI型摊片烤片机：湖北孝感宏业医用仪器有限公司。Tissue-Tek TEL组织包埋中心：日本SAKURA公司产品。 DMLS2光学显微镜：德国LEICA公司产品。
1.4 实验条件
实验大鼠均分笼饲养，饲喂全价颗粒饲料，自由饮水，室温(22±2)℃，55%～65%，光照适度，通风洁净。
1.5 实验统计
实验数据统计处理用±s表示,采用t检验,用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。
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2 实验方法
2.1 实验动物分组和MCAO模型的建立
选用健康雄性SD大鼠，体重280～320g，饲喂全价颗粒饲料，自由饮水，大鼠按简化分层随机法，随机分为6组,(1)假手术组: 给予等量生理盐水；(2)脑缺血再灌注模型组：给予等量生理盐水；(3)脑血康胶囊组：0.9g/kg；(4)化瘀通络方大剂量组：16g/kg；(5)化瘀通络方中剂量组：8g/kg；(6)化瘀通络方小剂量组：4g/kg。
以上除假手术组和脑缺血再灌注模型组给予等量生理盐水，其余各组大鼠灌胃给药，灌胃容量10mL/kg，每日一次，连续给药7天，实验前禁食不禁水，实验时以水合氯醛(30mg/kg)腹腔注射，待动物完全麻醉后，仰位固定于手术台上，颈部脱毛并消毒，于正中切开2cm，分离右侧颈总动脉(CCA)，颈外动脉(ECA)，颈内动脉(ICA)，结扎ECA和CCA近心端，于ECA和ICA分叉处在ECA上穿线打一活结。在ECA上剪一小口，插入直径0.235mm的尼龙渔线，缓慢向分叉处插入，直到到达分叉处有阻力不能再插入为止。将ECA上活结系紧，固定渔线。剪断ECA，轻轻提起ECA残端使其与ECA成一直线，再缓慢将渔线向ICA插入，栓线插入深度约为(18.0±1.0)mm，在分叉处结扎，松开动脉夹，缝合皮肤，体外留少许栓线，缺血2h后将栓线抽离颈总动脉分叉处造成再灌注模型。模型成功标志：动物麻醉清醒后出现缺血侧Hornor征及对侧以前肢为主的偏瘫。如动物无此体征或于2h后仍不清醒者剔除。假手术组只切开皮肤，分离CCA、ECA、ICA后缝合。手术后给予抗生素青霉素抗炎。继续给药3天。72h后断头取脑，免疫组化法测定HIF-1α及VEGF的表达。
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2.2 HIF-1α和VEGF免疫组化检测(采用免疫组化二步法)
①标本固定：取大鼠组织，10%中性甲醛固定，甲醛容量为组织标本的2-3倍。
②切片：10%中性甲醛固定24h后取大鼠组织，逐级酒精脱水，二甲苯透明、浸蜡，石蜡包埋，常规切片4μm，45℃水浴中捞片，80℃烤箱烤片，40min。
③石蜡切片脱蜡水化，置0.01 mol/L PH 6.0柠檬酸盐缓冲液中微波中档抗原修复20min。自然冷却，用PBS液(0.01mol/L PH7.4)冲洗3次×2min。
④正常山羊血清封闭，室温孵育10min。倾去血清，勿洗，滴加1∶50比例稀释的一抗，37℃孵育1h。⑤PBS冲洗，2min×3次。⑥滴加即用型快速免疫组化MaxVision【sup】TM【/sup】二抗，37℃或室温孵育10-15min。⑦PBS冲洗，2min×3次。⑧滴加新鲜配制的显色剂 (DAB ) 3-5min，显微镜下观察。⑨自来水充分冲洗，苏木素复染，自来水冲洗返蓝。⑩度酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。免疫组化标记结果：细胞浆呈棕黄色为阳性，在100倍镜下进行观察，200倍镜下进行计数。光学显微镜观察拍照，每张切片取5个视野计数阳性细胞数。
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2.3 化瘀通络方对脑缺血大鼠脑组织中HIF-1α和VEGF表达的影响结果
结果判定 HIF-1α、VEGF阳性表达为棕黄色颗粒。计分标准参照许良中等的方法，随机选取10个高倍视野约1000个细胞，计算阳性细胞百分比，结合染色强度进行评分，以两者乘积为最后得分：0分为阴性(-)，1～2分为弱阳性(+)，3～4分为阳性(++ )，5～6分为强阳性(+++ )。见表1。
表1 化瘀通络方对脑缺血大鼠脑组织中
HIF-1α和VEGF表达的影响
注：与假手术组比较，△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.05。
实验结果所示：脑缺血损伤后，脑组织中VEGF和HIF-1α表达增强，与模型组比较具有显著性差异(P<0.05,P<0.01)，说明脑血管损伤后促进了脑细胞的凋亡。采用化瘀通络方治疗后，高剂量组和中剂量组均可明显降低VEGF表达。高剂量组可明显降低HIF-1α表达。与模型组比较具有显著性差异(P<0.05，P<0.01)，说明化瘀通络方通过降低VEGF和HIF-1α的表达，保护脑缺血损伤后的脑细胞。见图1～2。, http://www.100md.com(朱萱萱 邱召娟 田磊 达庆国 吴旭彤 朱吾元)
关键词：化瘀通络方；MCAO；缺氧诱导因子-1α；血管内皮生长因子
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2011)04-0682-03
缺血性脑卒中(Ischemic Cerebral Stroke, ICS)，中医又称缺血性脑中风，是一种突然起病的脑部血液循环障碍性疾病。祖国医学将其列为“风、痨、臌、膈”四大疑难病之首。根据WHO公布的有关数据显示，世界范围内ICS的发病率为150～200人/10万人口。而在我国，60岁以上老年人ICS发病率高达30%～45%，幸存者中约50%留有不同程度的后遗症，且复发率高达40%～60%。对于脑卒中的治疗，药物方面提出了不少新理论和新方法，如抗凝、降纤、溶栓、钙离子拮抗剂、脑保护剂等，然而至今仍然未能取得突破性成果。我院神经内科经过多年的临床实践以化瘀通络法组方用于缺血性脑中风患者的治疗确切疗效【sup】[1]【/sup】。本研究建立MCAO动物模型，探讨化瘀通络方对局灶性脑缺血大鼠再灌注(MCAO)后的作用。以阐明化瘀通络方防治急性缺血性脑卒中的可能作用靶点。
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1 实验材料
1.1 实验药品
化瘀通络方由葛根、当归、补骨脂、制大黄、水蛭等组成，由江阴天江药业有限公司提供，批号：0910119；脑血康胶囊，山东昊福制药有限公司，批号：20100202；青霉素，山东鲁抗医药股份有限公司，批号：B091107；戊巴比妥钠，中国医药上海化学试剂公司，批号：F20091216Rabbit Anti-rat，HIF-1αAntbody：Rabbit AntVEGF；Antbody:即用型快速免疫组化MaxVision【sup】TM【/sup】试剂盒：福州迈新生物公司提供(KIT-5030)。DAB显色试剂等均由福州迈新生物公司提供。
1.2 实验动物和实验用饲料
SD大鼠，雄性，280～320g，由浙江大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(浙)2008-0033，实验用饲料由江苏省协同医药生物技术有限公司提供，批号20100325。
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1.3 实验用仪器
电子分析天平FA10047南京市计量测试所，80-2台式低速离心机，上海医疗器械有限公司手术器械厂，TP 1020自动脱水机：德国LEICA公司产品。RM2135型石蜡切片机：德国LEICA公司产品。 CS-VI型摊片烤片机：湖北孝感宏业医用仪器有限公司。Tissue-Tek TEL组织包埋中心：日本SAKURA公司产品。 DMLS2光学显微镜：德国LEICA公司产品。
1.4 实验条件
实验大鼠均分笼饲养，饲喂全价颗粒饲料，自由饮水，室温(22±2)℃，55%～65%，光照适度，通风洁净。
1.5 实验统计
实验数据统计处理用±s表示,采用t检验,用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。
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2 实验方法
2.1 实验动物分组和MCAO模型的建立
选用健康雄性SD大鼠，体重280～320g，饲喂全价颗粒饲料，自由饮水，大鼠按简化分层随机法，随机分为6组,(1)假手术组: 给予等量生理盐水；(2)脑缺血再灌注模型组：给予等量生理盐水；(3)脑血康胶囊组：0.9g/kg；(4)化瘀通络方大剂量组：16g/kg；(5)化瘀通络方中剂量组：8g/kg；(6)化瘀通络方小剂量组：4g/kg。
以上除假手术组和脑缺血再灌注模型组给予等量生理盐水，其余各组大鼠灌胃给药，灌胃容量10mL/kg，每日一次，连续给药7天，实验前禁食不禁水，实验时以水合氯醛(30mg/kg)腹腔注射，待动物完全麻醉后，仰位固定于手术台上，颈部脱毛并消毒，于正中切开2cm，分离右侧颈总动脉(CCA)，颈外动脉(ECA)，颈内动脉(ICA)，结扎ECA和CCA近心端，于ECA和ICA分叉处在ECA上穿线打一活结。在ECA上剪一小口，插入直径0.235mm的尼龙渔线，缓慢向分叉处插入，直到到达分叉处有阻力不能再插入为止。将ECA上活结系紧，固定渔线。剪断ECA，轻轻提起ECA残端使其与ECA成一直线，再缓慢将渔线向ICA插入，栓线插入深度约为(18.0±1.0)mm，在分叉处结扎，松开动脉夹，缝合皮肤，体外留少许栓线，缺血2h后将栓线抽离颈总动脉分叉处造成再灌注模型。模型成功标志：动物麻醉清醒后出现缺血侧Hornor征及对侧以前肢为主的偏瘫。如动物无此体征或于2h后仍不清醒者剔除。假手术组只切开皮肤，分离CCA、ECA、ICA后缝合。手术后给予抗生素青霉素抗炎。继续给药3天。72h后断头取脑，免疫组化法测定HIF-1α及VEGF的表达。
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2.2 HIF-1α和VEGF免疫组化检测(采用免疫组化二步法)
①标本固定：取大鼠组织，10%中性甲醛固定，甲醛容量为组织标本的2-3倍。
②切片：10%中性甲醛固定24h后取大鼠组织，逐级酒精脱水，二甲苯透明、浸蜡，石蜡包埋，常规切片4μm，45℃水浴中捞片，80℃烤箱烤片，40min。
③石蜡切片脱蜡水化，置0.01 mol/L PH 6.0柠檬酸盐缓冲液中微波中档抗原修复20min。自然冷却，用PBS液(0.01mol/L PH7.4)冲洗3次×2min。
④正常山羊血清封闭，室温孵育10min。倾去血清，勿洗，滴加1∶50比例稀释的一抗，37℃孵育1h。⑤PBS冲洗，2min×3次。⑥滴加即用型快速免疫组化MaxVision【sup】TM【/sup】二抗，37℃或室温孵育10-15min。⑦PBS冲洗，2min×3次。⑧滴加新鲜配制的显色剂 (DAB ) 3-5min，显微镜下观察。⑨自来水充分冲洗，苏木素复染，自来水冲洗返蓝。⑩度酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。免疫组化标记结果：细胞浆呈棕黄色为阳性，在100倍镜下进行观察，200倍镜下进行计数。光学显微镜观察拍照，每张切片取5个视野计数阳性细胞数。
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2.3 化瘀通络方对脑缺血大鼠脑组织中HIF-1α和VEGF表达的影响结果
结果判定 HIF-1α、VEGF阳性表达为棕黄色颗粒。计分标准参照许良中等的方法，随机选取10个高倍视野约1000个细胞，计算阳性细胞百分比，结合染色强度进行评分，以两者乘积为最后得分：0分为阴性(-)，1～2分为弱阳性(+)，3～4分为阳性(++ )，5～6分为强阳性(+++ )。见表1。
表1 化瘀通络方对脑缺血大鼠脑组织中
HIF-1α和VEGF表达的影响
注：与假手术组比较，△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.05。
实验结果所示：脑缺血损伤后，脑组织中VEGF和HIF-1α表达增强，与模型组比较具有显著性差异(P<0.05,P<0.01)，说明脑血管损伤后促进了脑细胞的凋亡。采用化瘀通络方治疗后，高剂量组和中剂量组均可明显降低VEGF表达。高剂量组可明显降低HIF-1α表达。与模型组比较具有显著性差异(P<0.05，P<0.01)，说明化瘀通络方通过降低VEGF和HIF-1α的表达，保护脑缺血损伤后的脑细胞。见图1～2。, http://www.100md.com(朱萱萱 邱召娟 田磊 达庆国 吴旭彤 朱吾元)