大鼠肾缺血-再灌注后p38MAPK蛋白表达的变化及银杏达莫注射液对其的影响(2)
 |
| 第1页 |
参见附件(5962KB，5页)。
肾脏对缺血-再灌注损伤(ischemia reperfusion injury)极为敏感。肾移植、严重创伤休克后延迟复苏均会导致不同程度的肾脏IRI【sup】[1-2]【/sup】，肾缺血-再灌注损伤(renal ischemia-reperfusion injury，RIRI)是发生急性肾衰竭及影响移植存活的重要因素，机制十分复杂。如何采取简便、有效的措施防止因肾脏IRI而导致的各种急慢性肾脏疾病，一直是国内外学者关注的重点、难点和热点。
近年来，有关器官缺血再灌注后细胞内信号通路的变化日益受到重视。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是细胞内重要的信号转导系统之一。MAPK家族由3个主要的亚族组成：ERK、JNK/SAPK和p38MAPK。ERKs主要作为细胞促有丝分裂增殖/分化的活化因子；JNK/SAPK和p38MAPK则主要参与细胞凋亡相关蛋白的应激活化【sup】[3]【/sup】。其中p38MAPK主要参与介导应激反应，细胞外多种应激原如放射线、紫外光、热休克、高渗液、促炎因子(如TNF-α,IL-1)等都可激活p38MAPK通路【sup】[4]【/sup】，活化后的p38MAPK以转位的方式进入细胞核，激活其下游的底物，影响细胞的增殖、分化、转化、凋亡等生物效应【sup】[5]【/sup】。银杏达莫注射液(Ginkgo biloba extract and Dipyridamole injection，XGD)是以银杏叶提取物(EGB)为基础的复合制剂，目前已在心脑血管疾病及糖尿病防治中发挥了重要的作用，但在防治RIRI方面的研究尚不多，值得进一步进行实验研究。本实验利用大鼠RIRI模型，观察银杏达莫注射对RIRI的保护作用及其对p38MAPK通路的影响，为临床应用银杏达莫注射液防治RIRI提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物及试剂 健康雄性Sprague-Dawley大鼠(清洁级)，体重200±20g，购自温州医学院实验动物中心，许可证号：SCXK(浙)2005-0019；银杏达莫注射液(山西普德药业有限公司生产，批号：20070601)，由乐清市人民医院提供；超氧化物歧化酶(SOD)﹑丙二醛(MDA)﹑尿素氮(BUN)﹑肌酐(Cr)检测试剂盒及蛋白定量试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自美国MBI公司。
1.2 仪 器 722N分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，聚合酶链式反应DNA扩增仪(美国Bio-Rad公司)，凝胶定量软件Quantity One(Bio-Rad公司)，Image-pro plus 5.0彩色图像分析系统(美国Media Cybernetics公司)，EXL-808酶标仪(美国Bio TeK公司)。
1.3 实验动物分组及方法 50只SD大鼠随机分为3组，每组10只。(1)对照组：按1.8mL/kg体重尾静脉注射生理盐水，每天1次，连续7天；(2)模型组：按1.8mL/kg体重尾静脉注射生理盐水，每天1次，连续7天；(2)银杏达莫注射液处理(高、中、低)组：按0.9、1.8、3.6mL/kg体重尾静脉注射XGD每天1次，连续7天。动物用药量是根据银杏达莫注射液的临床用药，利用大鼠与人的等效剂量换算方法计算得来。
1.4 标本收集 第8天每组大鼠经3%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后，仰卧位固定，作腹部正中3～4cm切口，分离肾周组织，暴露双侧肾脏，游离右侧肾脏结扎肾蒂并摘除右肾。假手术组不做其他特殊处理，模型组和药物处理组先用微动脉夹夹闭左肾蒂缺血1h，然后移去动脉夹再灌注1h建立缺血再灌注损伤模型。全部大鼠都经下腔静脉取血，血液标本用4000r/min高速离心机离心10min，留取上清液进行血肌酐(serum creatinine，Scr)和血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)检测，取肾组织分别以电镜和生化测定需要(置于液氮或-70℃冰箱中)保存备用。
1.5 MDA含量和SOD活性检测 用冰冷生理盐水做匀浆缓冲液制备肾组织匀浆，羟胺法测定SOD活性，TBA法测定组织MDA含量。按说明书操作实验步骤。
1.6 血清BUN和Cr含量的测定 取动物血清，二乙酰-肟法、苦味酸法分别测定血清BUN、Cr含量。实验步骤按说明书进行。
1.7 电镜检查 取大约1mm【sup】3【/sup】肾上极皮质，用生理盐水冲洗后浸入2.5%戊二醛溶液中固定2h，用生理盐水冲洗3次，再用1%锇酸固定1h。经丙酮梯度脱水，环氧树脂丙酮混合液37℃浸泡24h，纯环氧树脂37℃包埋剂包埋成块，修块定位后，超薄切片(切片厚约1μm-10μm)，电子染色，置于H-7500透射电镜下观察。
1.8 肾组织蛋白提取和蛋白印迹法(Western Blot)分析 把肾组织剪切成细小的碎片，取适量已加入PMSF的裂解液(50mM Tris (pH 7.4)，150mM NaCl，1% Triton X-100，1% sodium deoxycholate，0.1% SDS，sodium orthovanadate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin等)，匀浆，充分裂解后，12000g离心5min，取上清，用BCA法测定总蛋白浓度后，在12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白(80μg总蛋白/泳道)，然后转移到PVDF膜上，5%的脱脂奶粉封闭2h，分别加入p-p38MAPK抗兔多克隆抗体(1∶800)和p38MAPK抗兔多克隆抗体(1∶1000)，4℃过夜。次日TBST洗膜后加入抗兔HRP抗体(1∶3000)，室温摇床2h，洗膜后ECL发光，在暗室中用X线片显影适当时间，然后冲洗胶片，扫描各种样品的蛋白条带的吸光度(A)值 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(5962KB，5页)。