双参克癃方的提取工艺的优选
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摘 要：目的：优化双参克癃方的提取工艺。方法：采用正交试验法进行优选，以加水量、提取时间、提取次数为指标，考察哈巴俄苷和2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷的转移率，筛选双参克癃方的提取工艺条件。结果：最佳提取工艺为：加12倍量的水提取3次，每次1.5h。结论：该工艺稳定可行，适于生产。
关键词：双参克癃方；正交试验；提取工艺
中图分类号：R283文献标识码：A文章编号：1673-7717(2011)12-2793-04
Extraction Technology Of Shuangshen Kelong Granules
CHEN Yizhan,DING Yixue,LI Ying,QI Huchang,ZHANG Rusong
(Zhejiang Chinese Medicine University,Hangzhou 310053, Zhejiang,China)
Abstract:Objective: To establish the optimal extraction technology for Shuangshen Kelong Granules.Methods: The orthogonal test was employed for selecting the optimum of extraction technology. The investigation factors were the volume of water,time and times of extraction. The extraction technology of Shuangshen kelong granules was screened by the transfer rate of Stilbene glucoside and Harpagoside. Results: The optimum process is that 12 times of water,extracted 3 times, 1.5 hours per time.Conclusion: The extraction process is stable and suitable for industrial production.
Key words:Shuangshen KeLong Granules; orthogonal test ;extraction technology
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收稿日期：2011-06-21
作者简介：陈旖湛(1986-)，女，湖北宜昌人，硕士研究生，研究方向：天然药物活性成分的研究。
通讯作者：张如松(1950-)，男，教授，博士研究生导师，研究方向：天然药物活性成分的研究。双参克癃方是由玄参、丹参、生首乌等中药组成，来源于名老中医多年的临床验方。其中玄参为君药，具有补肾虚、泻火、改善微循环和毛细血管通透性、保肝及免疫促进等功能\[1\]。臣药何首乌具有抗衰老、降血脂、降低血小板与红细胞聚集、抗炎、镇痛等作用\[2\]。临床应用表明，本方治疗前列腺增生有显著的疗效，并能改善由前列腺增生引起的并发症。药效学实验表明，双参克癃方水提液可降低大鼠前列腺湿重、前列腺指数以及血清酸性磷酸酶含量(P<0.01)，抑制前列腺上皮细胞及基质的增殖，并降低大鼠腺体上皮细胞高度及腺腔皱褶指数(P<0.01)\[3\]。本实验采用正交试验法,以哈巴俄苷和2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷为考察指标对双参克癃方的提取工艺进行优化筛选。
1 材料与仪器
1.1 材料 处方所用药材均购自浙江华东医药股份有限公司药材参茸分公司，经浙江中医药大学张如松教授鉴定符合2005版《中华人民共和国药典》要求。标准品：哈巴俄苷(中国药品生物制品检定所，批号111730-200604)；2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷(中国药品生物制品检定所，批号110844-200606)。乙腈(色谱纯，美国TEDIA公司)，其他试剂为分析纯。
1.2 仪器 Waters高效液相色谱仪系统(美国Waters公司)：1525二元泵,717plus自动进样器，2996二极管阵列检测器， R-200型旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)，AB104-N型分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)。
2 方法及结果
2.1 正交实验设计
为了确定最佳的提取工艺，对加水量(A)、提取时间(B)、提取次数(C)进行了考察，以哈巴俄苷和二苯乙烯苷的转移率作为评价指标进行工艺优选。水提工艺的因素水平设置如表1。
2.2 哈巴俄苷的含量测定
2.2.1 色谱条件 色谱柱：Kromasil 100-5 C18柱(250mm×4.6mm)；流动相：以乙腈为流动相A，以1%醋酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为278nm；流速：1.0mL·min-1；柱温：25℃。
2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取哈巴俄苷对照品11.58mg，制成每1mL含9.26μg的对照品溶液。
2.2.3 供试品溶液的制备 称取9份一个处方量药材饮片，采用回流提取法，按照L9(34)正交表安排试验。精密吸取10μL，注入液相色谱仪，测定提取液中哈巴俄苷的含量(见图1~3)。
2.2.4 线性关系考察 以哈巴俄苷的峰面积为纵坐标(Y)，哈巴俄苷的对照品溶液浓度(mg·mL-1 )为横坐标
图1 哈巴俄苷对照品溶液HPLC图谱
图2 复方水提液哈巴俄苷HPLC图谱
图3 缺玄参阴性对照溶液HPLC图谱(X)，进行线性回归，得回归方程为Y=1.26×107X-29991，r=0.9999，结果表明：哈巴俄苷在0.037～1.186μg范围内有良好线性。
2.3 二苯乙烯苷的含量测定
2.3.1 色谱条件 色谱柱：Kromasil 100-5 C18柱(250mm×4.6mm)；流动相：乙腈-水(20∶ 80)，检测波长320nm；流速：1.0mL·min-1；柱温：25℃。
2.3.2 对照品溶液制备 精密称取二苯乙烯苷对照品11.08mg，制成每1mL含0.22mg的对照品溶液。
2.3.3 供试品溶液的制备 与“哈巴俄苷供试品溶液的制备”项下供试品溶液的制备方法相同。测定提取液中哈巴俄苷的含量(见图4~6)。
2.3.4 线性关系考察 以二苯乙烯苷的峰面积为纵坐标(Y)，二苯乙烯苷的对照品溶液浓度(mg·mL-1 )为横坐标(X)，计算回归方程为Y=2.53×107X-15640，r=0.9997，结果表明：二苯乙烯苷在0.277～8.864μg范围内有良好线性。
2.4 水提工艺的正交试验结果
按2005年版《中华人民共和国药典》1部方法测定\[4\]，玄参药材中哈巴俄苷的平均含量(n=2)为0.11%，生首乌药材中二苯乙烯苷的平均含量(n=2)为1.2%。按L9(34)正交试验考察加水量、提取时间、提取次数的影响，根据综合加权评分方法，按权重系数(哈巴俄苷∶ 二苯乙烯苷= 0.6∶ 04)对水提工艺正交试验结果进行极差分析和方差分析见表2~3。
极差分析显示：各因素对提取率影响的大小顺序为C>A>B。方差分析显示：C因素对提取效率有显著性影响，A因素对提取效率有较显著的影响，B因素对提取效率
图4 二苯乙烯苷对照品溶液HPLC图谱
图5 复方水提液二苯乙烯苷HPLC图谱
图6 缺生首乌阴性对照溶液HPLC图谱无显著性差异。最佳水提工艺为C3A3B2，即加12倍量的水提取3次，每次1.5h。
3 水提工艺的验证试验结果
取同一批药材，称取3个处方量按照C3A3B2水提工艺提取,测定哈巴俄苷和二苯乙烯苷含量及转移率，结果见表4。
结果显示，哈巴俄苷和二苯乙烯苷的含量及转移率都与正交结果相符合，含量和转移率均较高，说明正交试验得到的最佳工艺切实可行，稳定可靠，因此确定最佳水提工艺为：加12倍量的水提取3次，每次1.5h。
表2 水提工艺L9(34)正交试验设计及统计处理
收稿日期：2011-07-26
作者简介：方红英(1966-)，女，浙江诸暨人，副主任药师，学士，研究方向：中药制剂研究。4 讨 论
中药的提取效果直接关系到中药的质量和疗效，并对中药的临床应用效果产生了影响，所以提取工艺的考察是一个在药品开发中不容忽视过程。本方中玄参中的有效成分哈巴俄苷，何首乌中的2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷都是水溶性的成分，因此考虑其水提。以哈巴俄苷和二苯乙烯苷的转移率作为评价指标进行
注：F0.10(2,2)=9.000；F0.05(2,2)=19.00；F0.01(2,2)=9900
工艺优选，来确定双参克癃方的最佳提取工艺。由于水提之后，药方的药液量较大，为了使用方便和进一步分离精制，后续的纯化工艺还需要进一步进行。
参考文献
[1] 师怡，许晖，阙慧卿，等.玄参化学成分的药理作用和分析方法\[J\].海峡药学,2006,18(4):58-59.
\[2\] 李建平.何首乌药理作用研究近况\[J\].中国药业,2003,12(10):74-75.
\[3\] 黄维洁，戚虎昶，徐锦龙，等.双参克癃方的抗前列腺增生作用\[J\].中华中医药学刊2010,2(28):404-407.
\[4\] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：1部\[S\].北京：化学工业出版社，2005., 百拇医药(陈旖湛 丁艺雪 李膺 戚虎昶 张如松)