芪白平肺胶囊对慢阻肺痰瘀阻肺证模型大鼠T淋巴细胞亚群的影响(2)
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参见附件。
1.1.3药物与试剂芪白平肺胶囊，由安徽中医学院第一附属医院制剂中心提供；硝苯地平片，10mg/片，南京白敬宇制药有限责任公司(批号：H32024516)；川芎嗪注射液，20mg/mL，南宁枫叶药业有限公司 (批号：H45021474)。T淋巴细胞亚群试剂盒，美国Beckman Coulter公司。
1.2模型建立
参照李泽庚[4]造模方法，建立病证结合动物模型。依据“劳则气耗”(《素问•举痛论》)，每天将大鼠放入恒温水槽(43±1)℃中强迫游泳30min，使其劳累而耗伤肺气；然后置于1m3熏烟箱内，每天香烟熏1h，每次20支去过滤嘴红梅牌香烟.最后将大鼠置于常压低氧装置内(每天7h)，通入氮气，用自动测氧仪调控氧浓度至(10±0.5)%；CO2传感器控制舱内CO2始终维持在0.03%。温度传感器及其控制电路可维持舱内温度始终恒定在22～24℃。蒸气由变色硅胶吸收(烘干后可反复使用)，装置有一小孔与外界相通，确保舱内的常压状态，舱体由透明有机玻璃制造，可观察大鼠活动、进食、饮水等情况。造模每周进行6天，第7天暂停，连续4周。
1.3给药方法
每天造模结束后灌胃，空白组、模型组每天生理盐水灌胃10mL/kg，芪白平肺胶囊高剂量组、芪白平肺胶囊低剂量组每天给药量分别为1000mg/kg、250mg/kg(每毫升含芪白平肺胶囊50mg)，硝苯地平组每天剂量20mg/kg，川芎嗪组每天剂量10mL/kg(每毫升含川芎嗪20mg)。每只大鼠每天灌胃1次，直至造模结束，造模结束次日测大鼠T淋巴细胞亚群指标。
1.4观察指标与方法
1.4.1一般状况观察各组大鼠呼吸、毛发、活动量、食量、体质量等情况。
1.4.2T淋巴细胞亚群(CD+3、CD+4、CD+8、CD+4/CD+8)的测定 将大鼠用2%的戊巴比妥按1mL/kg腹腔注射麻醉后，经腹主动脉采血。分别取各组抗凝全血100μL，分别先后加入10μL CD+3、CD+4、CD+8抗体，平行设3管同型对照。室温下避光孵育15～30min，加入红细胞裂解液1mL，室温避光放置15～20min，振荡混匀，1400r/min离心5min，弃上清，用2mL PBS洗涤1次，加入400μL PBS重新浮悬细胞，上流式细胞仪检测。全部数据用流式细胞仪和CELL QUEST软件进行荧光参数获取和分析。在前散射和侧散射的二维Dot-plot图中，划出淋巴细胞区，然后对淋巴细胞做FITC和PE的荧光强度检测，荧光Ⅰ为FITC，滤光片为(530±10)nm带通；荧光Ⅱ为PE，滤光片为(575±10)nm带通。数据分析时，在确定每次检测阳性细胞百分率之前，根据lsotype的非特异性荧光强度设定界限，以确定双阴性、双阳性和单阳性区。
1.5统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件分析。所有数据进行正态性检验，计数资料用(±s)表示。两样本均数比较采用独立样本t检验。相关分析采用Spearman相关分析法，检验水准为0.05。
2结 果
2.1一般状况观察
正常组、芪白平肺胶囊高剂量组活泼好动，毛发光泽，体质量逐渐增加，呼吸平稳；模型组、硝苯地平组活动量减少，行动迟缓，拱背蜷卧，撮毛，食量减少，体质量增幅减低，呼吸急促，咳嗽，口鼻分泌物增多，偶可闻及气道痰鸣音，鼻部、唇周及爪甲紫绀；川芎嗪组、芪白平肺胶囊低剂量组观察指标介于正常组和模型组之间。
2.2T淋巴细胞亚群的测试
模型组CD+3、CD+4、CD+4/CD+8较正常组明显下降(P<0.01)，模型组CD+8较正常组明显升高(P<0.01)；芪白平肺胶囊高剂量组各参数与正常组无差异(P>0.05)；硝苯地平组各参数较模型组无差异(P>0.05)；川芎嗪组各参数较模型组及芪白平肺胶囊高剂量组均有显著差异(P<0.01)；芪白平肺胶囊低剂量组各参数较模型组及芪白平肺胶囊高剂量组均有显著差异(P<0.01)。见表1。由测定结果可见，高剂量芪白平肺胶囊可升高慢阻肺痰瘀阻肺证CD+3、CD+4、CD+4/CD+8水平升高，降低CD+8水平，疗效优于川芎嗪及硝苯地平。
3讨 论
3.1祖国医学对慢阻肺的认识
祖国医学认为慢阻肺与“肺胀”相类似，早在《内经》就有关于肺胀的记载，《灵枢•胀论》：“肺胀者，虚满而喘咳。”《灵枢•经脉》：“肺手太阴之脉……是动则病肺胀满膨膨而喘咳。”《金匮要略•肺痿肺痈咳嗽上气病篇》指出本病的主症是：“咳而上气，此为肺胀，其人喘，目如脱状。”《痰饮咳嗽病脉证并治》：“咳逆依息，短气不得卧，其形如肿。”《丹溪心法•咳嗽篇》提出肺胀是痰瘀阻碍肺气所致，可用四物汤加桃仁等治疗，开活血化瘀治疗肺胀之先河。本病病变首先在肺，继则影响脾、肾，后期病及于心。病理因素主要为痰浊、水饮与瘀血互为影响，如痰从寒化则成饮；饮溢肌表则为水；痰浊久留，肺气郁滞，肺失治节，心脉失畅则成瘀，瘀阻血脉，“血不利则为水”。早期以痰浊为主，渐而痰瘀互见，终至痰浊、血瘀、水饮错杂为患。
3.2 芪白平肺胶囊的立法与组方原则
本方证候乃肺气亏虚，阳气微弱，痰瘀互结所致。肺为气之主，主一身之气。肺气虚则宣肃失常而咳嗽、喘促；肺气虚则治节失常，水液不循常道凝聚为痰，血液运行无力停滞为瘀，可见咳痰、下肢浮肿；病程日久，气损及阳，阳气亏损则畏寒肢冷；舌脉之象乃气虚阳微痰瘀互结之征。方中黄芪甘温而入脾肺经，大补脾肺之气为君药。川芎为“血中气药”具有行气活血之效为臣药。地龙清肺定喘、通行经络为佐使药。诸药合用，补肺气，温阳气，使痰消瘀散。
3.3检测指标
在T细胞亚群中，CD+3的下降表明外周血中成熟T细胞总数下降，它是由于CD+4下降所致。CD+4是辅助性T淋巴细胞，该细胞减少使产生淋巴细胞、协助B细胞产生抗体和辅助其它淋巴细胞的功能减弱，显示机体免疫功能下降。CD+8是抑制性T淋巴细胞，它一方面有助于消除病原体，但当其细胞数量过度则可引起机体的损害。目前普遍认为COPD是一种慢性气道炎症，中性粒细胞、嗜酸粒细胞、肺泡巨噬细胞和淋巴细胞似乎都参与了炎症过程。以往研究结果显示，老年COPD患者由于营养不良、感染和吸烟等多种因素的影响，细胞免疫功能降低[6]。COPD常有免疫功能低下，因此常把提高机体免疫功能作为治疗和预防COPD的有效途径之一[7]。有学者认为COPD是一种以细胞毒性/抑制型T细胞和巨噬细胞浸润为主的慢性炎症性疾病，气道内多种炎性细胞与炎性介质的相互作用，其中T细胞亚群的失常在COPD的发生、发展过程中起重要作用[8]。
T细胞亚群的变化可能是COPD的发病机制之一，COPD患者免疫功能的降低,是导致COPD患者易感染且感染不易控制的原因之一。目前COPD的治疗仍然以改善症状为主,没有明确能够逆转病程进展的治疗措施,对T淋巴细胞免疫反应在COPD发病机制中的重要作用的认识可能对寻找更新更有效的治疗方法有提示作用。本实验采用复合因素造模方法建立病证结合慢阻肺痰瘀阻肺证大鼠模型 ......
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