电针对慢性坐骨神经压迫性损伤大鼠神经病理学及背根神经节P2X3受体表达的影响(2)
 |
| 第1页 |
参见附件。
电针(electroacupuncture，EA)是在传统针刺刺激腧穴的基础上，叠加多种频率、模式的脉冲电流，以加强刺激、增强疗效的现代针灸疗法，已被广泛应运用于临床治疗中，尤其镇痛效果较好而常用于疼痛性疾病[1]。神经病理性疼痛是由中枢或外周神经系统的损伤和功能紊乱引起的慢性疼痛[2]，不仅对机体有害，而且持续时间长，常导致患者生活质量降低。电针在神经病理性疼痛上具有显著的镇痛作用，而ATP及其P2X3受体在伤害性信息的传递中具有重要的作用，研究显示P2X3受体参与了神经病理性痛[3]。本实验通过电针干预CCI模型大鼠，观察坐骨神经组织学的改变及P2X3受体在DRG神经元中表达的变化，旨在为进一步研究及临床应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验动物和分组
32只成年清洁级雄性SD大鼠(由温州医学院实验动物中心提供)，体重150~180g，随机分为假模组、 模型对照组、健侧EA组、患侧EA组，每组8只，其中假模组仅暴露坐骨神经，其余3组造成坐骨神经慢性压迫性损伤(chronic constrictive injury , CCI)疼痛模型。
1.2 模型制备
建立大鼠CCI模型，5%水合氯醛(0.6mL/100g)腹腔注射麻醉；固定后大鼠右侧后肢去毛备皮，常规消毒，沿右股骨切开皮肤，钝性分离肌肉；暴露坐骨神经，用4-0号铬制羊肠线在坐骨神经分叉前打4次松结，间隔1mm使神经外膜稍稍受压，松紧度以大腿肌肉或足指轻微抽动，不影响神经外膜的血运为度，不可过紧；分别缝合肌肉和皮肤，表面清洁消毒，包扎，放回鼠笼饲养。其中假模组仅暴露坐骨神经2~3min，不打结，其余手术操作相同。
1.3 痛阈测定
1.3.1 足机械足反射阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT) 的测定 于术前(0天)及术后3、5、7、10、12、14天，采用2450型爪痛觉测试仪测定各组大鼠MWT值，于安静大鼠右前足底加压至逃避性抬腿或右后肢抽动，记录抬腿时施加于大鼠足底的最大力度(g)，重复6次，间隔5min，去掉最大值和最小值后取平均值。
1.3.2 热缩足反射潜伏期(thermal withdrawal latency , TWL) 于术前(0天)及术后3、5、7、10、12、14天，采用37370型爪热觉测试仪测定各组大鼠TWL 值。仪器发射红外光照射大鼠右后爪足底，安静大鼠逃避性抬腿时，仪器自动感应切断热源记录开始照射至出现缩足逃避反射时间(s)，重复5次，间隔10～15min，去掉最大值和最小值后取平均值，红外光照射截止时间为40s，以防大鼠足底灼伤。
1.4 电针干预方法
将大鼠适度固定于自制改良的大鼠针刺固定器(专利申请号：201110021482.5)，相应部位剪毛备皮，安静后用3mm皮内针针刺“足三里”-“阳陵泉”穴，垂直进针2～3mm 。采用韩氏电针治疗仪，2mA，2/100Hz交替波脉冲电流连续刺激(以腿部肌肉轻微抽动为度)，每日1次(每日固定时间)，每次持续30min，连续干预7天。假模组和CCI模型对照组不予以电针处理。
1.5 取材、灌注固定和组织切片
术后第14天电针干预及测定痛阈后，10%水合氯醛(0.4mL/100g体重)腹腔注射深度麻醉。开胸，经左心室插管行心脏灌注固定，先快速灌注温生理盐水100mL，再灌注4%的多聚甲醛磷酸缓冲液(phosphatebufferedsaline，PBS)(0.1 mol/L，pH值7.2～7.4)200mL。1h后及时取右侧L5背根神经节(dorsal root ganglion , DRG)及结扎处以下长约5mm坐骨神经，置4%的多聚甲醛PBS液内后固定，石蜡包埋，每块组织连续切片，用于组织学观察及免疫荧光组化检测。
1.6 组织学观察及免疫荧光组织化学检测
1.6.1 坐骨神经组织切片 经HE染色，光镜下观察。根据Estebe等[4]评分方法行坐骨神经组织学分级评分。由同一病理科医师阅片，将每组大鼠的坐骨神经病理组组织学评分进行累加。
1.6.2L5 DRG组织切片 64℃烤1h，脱腊，抗原修复，3%H2O2孵育10min以灭活内源性过氧化物酶化酶；滴加封闭液，37℃孵育1h；滴加稀释的P2X3一抗(1：500)覆盖标本，37℃孵育1h；0.1%TBSTs洗涤液冲洗；去除洗涤液，滴加稀释的荧光标记二抗(1：1000)覆盖标本，避光孵育1h；0.1%TBSTs洗涤液冲洗；滴加抗荧光淬灭封片液覆盖标本，封片，显微镜下观察。
1.7 统计学分析
所得数据均用平均值±标准差(±s)表示，所有数据经SPSS统计软件16.0版本处理，组间差异分析采用单因素方差分析，后进行LSD检验，P<0.05表示差异具有显著性意义。
2 结 果
2.1 模型成功的鉴定
CCI模型制备后大鼠出现跛行，足呈轻度外翻状，且有时出现舔舐、悬空等后肢保护现象，表明坐骨神经慢性压迫性损伤模型制备成功。
2.2 行为学观察
2.2.1 大鼠患侧足机械足反射阈值(MWT)
假模组大鼠MWT值术后第3天降低，与术前相比差异均有统计学意义(P<0.05)，之后缓慢升高，第14天，与术前差异均无统计学意义(P>0.05)。模型对照组大鼠MWT值术后第3天明显降低，与术前相比差异均有显著统计学意义(P<0.01)，之后缓慢下降，第14天，与术前相比差异均有显著统计学意义(P<0.01)。电针治疗后，模型手术大鼠MWT值持续升高。健侧电针组与患侧电针组大鼠术后第14天的MWT值较术后第7天均明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；且两电针组大鼠术后第14天MWT值明显高于模型对照组而明显低于假模组，差异均有统计学意义(P<0.05)。患侧电针组大鼠电针治疗后MWT值升高幅度大于健侧电针组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1(其中b为a的直观图)。
2.2.2 大鼠患侧足热缩足反射潜伏期(TWL) 假模组大鼠TWL值术后第3天降低，与术前相比差异均有统计学意
义(P<0.05)，之后缓慢升高，第14天，与术前差异均无统计学意义(P>0.05)。模型对照组大鼠TWL值术后第3天明显降低，与术前相比差异均有显著统计学意义(P<0.01)，之后缓慢下降，第14天，与术前相比差异均有显著统计学意义(P<0.01)。电针治疗后，模型手术大鼠TWL值持续升高 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(2507kb)。