铁皮石斛与市场上常见的几种伪品含糖量的测定(2)
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参见附件。
2 方 法[8]
2.1 甘露糖的测定
2.1.1 色谱条件和方法
色谱柱：Ultimate XB-C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为乙腈-0.02mol•L-1乙酸铵溶液(18∶82)，流速1.0mL•min-1，柱温30℃，检测波长：250nm，进样体积10μL。在此色谱条件下，甘露糖与样品中的其他色谱峰达到基线分离。按照甘露糖峰计算，理论板数应不低于4000。对照品和样品色谱图见图1。
2.1.2 内标溶液和对照品的制备
取盐酸氨基葡萄糖适量，精密称定，加水制成每1mL含12mg的溶液，备用。
取甘露糖对照品约10mg，精密称定，置100mL容量瓶中，精密加入内标溶液1mL，加水适量使溶解，用水定容至刻度，摇匀，即配成0.1 mg•mL-1对照品溶液。
2.1.3 样品溶液的制备
新鲜石斛药材(见表1)，60℃烘箱烘干、粉碎。取石斛粉末(过3号筛)约0.12g，精密称定，加80%乙醇80mL置索氏提取器中提取4h，弃去乙醇液，药渣挥干乙醇，滤纸筒拆开后置于圆底烧瓶中，加水100mL，精密加入内标溶液2mL，称重，回流1h，放冷，加水补至约100mL，混匀，滤过，取续滤液1mL置于安瓿瓶中，加入3.0mol•L-1的盐酸溶液0.5mL，封口，混匀，110℃水解1h。冷却后，开封，用3.0mol•L-1的氢氧化钠溶液调节pH值至中性，即得供试品溶液。
2.1.4 样品的测定
取对照品溶液与供试品溶液各400μL，分别加0.5mol•L-1的PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)甲醇溶液与0.3mol•L-1的氢氧化钠溶液各400μL，混匀，70℃水浴反应100min。再加0.3 mol•L-1的盐酸溶液500μL，用三氯甲烷洗涤3次，每次2 mL，弃去三氯甲烷液，水层离心10min后，吸取上清液，注入液相色谱仪，记录各色谱峰，结果见表2。.
2.2 石斛多糖的测定
2.2.1 葡萄糖对照品溶液的配制
取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成每1mL含90μg的对照品溶液，备用。
2.2.2 多糖的提取和制备
新鲜石斛药材(见表1)60℃烘箱烘干、粉碎。取石斛粉末(过3号筛)约0.12g，精密称定，加水80mL，加热回流2h，提取液转移至100mL容量瓶中，用适量水多次洗涤容器，洗涤液转移至同一容量瓶中，冷却，加水稀释至刻度，摇匀，滤过。精密吸取续滤液2mL，置15mL离心管中，精密加入无水乙醇10mL，摇匀，冷藏1h，取出，离心30min，弃去上清液，沉淀物加80%乙醇洗涤2次，每次8mL，离心，弃去上清液，沉淀物加热水溶解并转移至25mL量瓶中，冷却，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
2.2.3 标准曲线的绘制
精密量取葡萄糖对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置10mL具塞试管中，加水至1.0mL。精密加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，再精密加入浓硫酸5mL，摇匀，置沸水浴中加热20min，取出，放入冰浴中冷却5min，以相应的试剂为空白，在488nm的波长处测定吸光度，以吸光度(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程，即A=0.633C+0.0027(R2=0.9957)，结果表明，葡萄糖浓度在2.571～12.857μg•L-1内与吸光度(A)线性关系良好。
2.2.4 样品测定
精密量取供试品溶液1mL，置10mL具塞试管中，照标准曲线绘制项下的方法，自“精密加入5%苯酚溶液1mL”起，依次测定吸光度，代入回归方程计算葡萄糖的质量浓度，再按下式计算多糖的量：多糖的量(%)=CD/W×100%。
式中C为供试液中葡萄糖的质量浓度(mg/mL)，D为供试液的稀释倍数，W为供试品量,结果见表2。
3 结果与分析
3.1 石斛多糖含量比较
石斛多糖与甘露糖含量结果见表2。从表中可以看出，含糖量最高的为S2，含量为44.43%；其次是S1，含量为41.08%；含量最低的为S4，只有20.23%。各个不同产地的石斛含糖量差别甚大，究其原因可能与其种植环境、生长年限、生长状况及植物本身的遗传特性有关，这有待于进一步深入研究。本实验收集的石斛，其伪品平均多糖含量为36.59%，而铁皮石斛的平均多糖含量为33.02%，两者相差3.57%，铁皮石斛含糖量最高值与伪品相差9.82%。铁皮石斛由于来源不同其多糖含量相差甚大，伪品和铁皮石斛间多糖含量无一定的规律性。因此，传统认为“质重、嚼之粘牙、味甘、无渣者为优品”[9]衍生的以多糖含量作为石斛质量评价指标存在一定的误区。
3.2 石斛甘露糖含量和峰面积比值比较
表中可以清晰地看出，甘露糖含量中S3居首位，含量为34.17%；其次是S2，含量为32.96%；含量最低的为S4，含量为17.60%。本实验中伪品的甘露糖平均值含量为29%，铁皮石斛的平均含量为27.26%，两者的平均含量相差1.74%，铁皮石斛甘露糖最高值与伪品最高值相差2.27%，两者相差甚大。由表显示，甘露糖在各个石斛属药材中所占的比例是不等的，从而其与葡萄糖的峰面积之比也不同，但在多糖和甘露糖含量相当的石斛中，如S1和S2，其甘露糖和葡萄糖峰面积比值相差很大，说明石斛水溶性多糖是由各种不同的单糖组成的[10]，由此可以推断出组成石斛水溶性多糖的单糖成分是多元化的，决定了各种石斛的药理作用的差异。
4 讨 论
关于石斛多糖含量测定，前人有一些研究报告。刘宏源等[7]对5批野生种源的经人工培植的铁皮石斛含量进行测定，结果为17.76%～29.19%。孙卓然等[11]对几种不同石斛多糖含量测定结果为：8.27%～28.28%。而笔者测定的结果为20.23%～44.43%。不同实验结果测得石斛多糖含量存在差异的原因，除了不同地区的石斛药材确实存在着化学成分的差异外，石斛的不同生长状况、不同采收期及采样的代表性等问题也是造成不同石斛多糖含量不一的原因。
2010年版《中华人民共和国药典》规定：铁皮石斛按干燥品计算，含铁皮石斛多糖以无水葡萄糖(C6H12O6)计，不得少于25.0%，含甘露糖应为13.0%～38.0%，甘露糖峰面积与葡萄糖峰面积的比值应为2.4～8.0。表2数据显示，铁皮石斛的多糖和甘露糖含量均符合药典规定，而伪品也基本上符合药典规定。本实验所测的石斛中，铁皮石斛和伪品含糖量高低并无一定的规律，不能以此单独作为评价石斛质量优劣的指标。因此我们应结合其它技术手段，如分子生物学鉴定、薄层分析、显微鉴定或HPLC等，将品种研究、药效物质基础研究与质量标准研究相结合，才能制定出合理、科学的质量评价标准，从而避免商品石斛“鱼龙混杂”的局面，提高行业整体的质量水平。
参考文献
[1] 李满飞, 徐国钧,徐珞珊,等 ......
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