原发性肝癌阳虚证患者血清代谢组特征初步研究(2)
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Key words:primary liver cancer; metabonomics; Yang deficiency syndrome; nuclear magnetic resonance spectroscopy; serum; partial least squares discriminant analysis(PLS-DA)
目前原发性肝癌证候客观化的探索主要局限在生化、免疫、肿瘤标志物等指标与证候的关系上。这些指标与证候所具有的整体观念的中医“证”的内涵相去甚远，致使证本质的研究没有大的突破。这种状况将极大地阻碍了临床辨证论治和疗效判断的规范化，不利于达到循证医学要求的临床研究项目的实施。因此，寻求一种既能反应肝癌中医证候内涵又能为证候提供量化分析的研究方法十分迫切。
代谢组学是关于生物体内源性代谢物质的整体及其变化规律的科学[1]，其中心任务包括检测、量化和编录生物内源性代谢物质的整体及其变化规律，联系该变化规律与所发生的生物学事件或过程的本质[1]。从定义本身不难看出，代谢组学是将生物体作为一个动态的整体研究其内因或外因导致的代谢变化，这个定义的关键在于其整体性和动态性。这对于揭示复杂性疾病的机理具有独特的优势，与中医学的整体观、系统观和辨证论治思维非常吻合。阳虚证是肝癌重要基本证候之一，具有较突出的证候特征，因此，本研究选择阳虚证患者作为研究对象，以基于核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)波谱技术代谢组学方法来探讨原发性肝癌阳虚证患者血清代谢模式特征，期望为肝癌阳虚证的客观化提供依据。
1资料与方法
1.1一般资料
所以病例来自2007年10月-2009年5月期间长海医院中医科原发性肝癌患者，原发性肝癌的诊断标准符合2001年“原发性肝癌的临床诊断与分期标准”中临床诊断标准[2]，肝癌阳虚证患者的诊断标准符合原发性肝癌基本证候定性诊断标准，肝癌非阳虚证患者是应用原发性肝癌基本证候量化分析模型[3]阳虚证积分为0的患者。阳虚证组21例，男18例，女3例，年龄(55.76±12.79)岁，非阳虚证组21例，男19例，女2例，年龄(58.10±7.31)岁，两组在性别、年龄、肝功能Child-pugh分级、肝癌临床分期方面具有较好的一致性(P>0.05)。
1.2血清样品采集
纳入研究人员凌晨空腹8h后抽取静脉血5mL，静置2h后，室温下离心3500r/min×15min，吸取上清，分装于EP管存放在-80℃超低温冰箱备用。
1.3主要仪器与试剂
AVANCE II 600 MHz NMR波谱仪是瑞士Bruker公司产品；2,2,3,3-三甲基甲硅烷基丙酸钠{3-(trimethylsiyl) [2,2,3,3-2H4] propionate,TSP}为美国Aldrich公司产品；重水(deuterium oxide，D2O)为美国CIL公司产品。
1.4血清检测前预处理
血清样品室温下解冻，吸取上清400μL，加入TSP和D2O，使TSP终浓度为0.048%，振荡混匀，转移至5mm的NMR试管中待检测。
1.5NMR数据采集
在第二军医大学药学院分析检测中心NMR实验室进行检测。把装有经过预处理血清的NMR试管上机检测。在Bruker AVANCE II 600 MHz NMR波谱仪上记录血清一维质子磁共振氢谱(proton nuclear magnetic resonance，1H NMR)。采用Bruker公司的BBI(broad-band-inverse)探头，300K实验温度，预饱和方式抑制水峰，弛豫时间编辑(Carr-Purcell-Meiboom-Gill，CPMG)脉冲序列抑制血清中蛋白质及脂蛋白较宽的共振信号。采样时间2.04s，驰豫时间3.04s，谱宽7289Hz，采样点数64k，叠加次数128次。自由感应衰变(free induction decay, FID)信号经过32k傅立叶变换转为1H NMR谱图。以TSP为化学位移参考峰的位置，设为0ppm，校正化学位移后，对所获谱图进行相位和基线校正。
1.6数据处理和差异代谢物的鉴定
应用TopSpin 2.0把校正标准化后图谱转换成ASCⅡ TXT格式文件。根据分组要求把相对分组的数据放入同一文件夹。为了排除抑制水峰过程中变量的寄生效应(spurious effects)，删除1H NMR谱中4.60~5.00ppm水溶剂峰的区段。由于0.2~10ppm以外的区段可能有较多假象的干扰，而且内源性代谢物通常在0.2~10ppm以内的区段，所以分析数据的时候删除1H NMR谱中0.20~10.00 ppm的区段。实际分析的区段是0.2~4.6ppm和5.0~10ppm，按0.04ppm分段等距积分，以TSP内标(0ppm)为相对浓度的参照标准，采用Matlab7.0应用偏最小二乘法判别分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)对所有数据进行处理。对PLS-DA得分图提示能明显区分不同分组的差异代谢物(P<0.05)，进一步用t检验或秩和检验验证组间差异的统计学意义，得到代表组间差异代谢物的变量，显示为等距积分所在化学位移分段中点的化学位移值。根据该变量在1H NMR谱中的化学位移值，检索代谢组学1H NMR化学位移数据库(http://www.ebi.ac.uk/nmrshiftdb/)、人类代谢产物数据库HMBP(http://www.hmdb.ca)和参照1H NMR检测相关文献[4-6]确认其所代表的物质 ......
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