止咳平喘合剂影响哮喘大鼠嗜酸粒细胞及Eotaxin表达的实验研究(2)
 |
| 第1页 |
参见附件。
Key words:Zhike Pingchuan Mixture; asthma;eosinophil; eotaxin
气道炎症是哮喘气道高反应性AHR的基础，EOS是哮喘的支气管黏膜特征性炎症中关键的效应细胞[1-2]。EOS的趋化、活化、脱颗粒作用受多种细胞因子调节，其中Eotaxin是目前发现作用最强、最专一的因子，在哮喘的发病过程中，它可与EOS表面的CCR3受体特异性结合，从而募集、趋化和激活EOS[3-5]。本实验通过建立大鼠哮喘动物模型，观察止咳平喘合剂对哮喘大鼠Eotaxin表达的影响，探讨其能否通过抑制Eotaxin表达而发挥疗效，从而进一步深化探讨名老中医经验方的作用机制。
1材料与方法
1.1实验动物分组健康成年雄性SD大鼠60只，清洁级，体重(200±20)g，由浙江中医药大学动物实验中心提供。随机分为6组：空白对照组、模型组、阳性对照组、止咳平喘合剂大剂量组、止咳平喘合剂中剂量组、止咳平喘合剂小剂量组，每组动物均为10只。实验动物饲养于浙江中医药大学动物实验中心三级实验动物房内。
1.2实验药物及试剂OVA(V级)由美国Sigma公司提供；止咳平喘合剂由浙江中医药大学中药制剂室制成流浸膏，含生药2.0g/mL；强的松片由浙江仙居制药股份有限公司生产；羊抗Eotaxin蛋白多克隆抗体(编号：BA1469)由武汉博士德生物技术司提供；免疫组化试剂盒(批号：10N1775A)由丹麦DAKO公司提供
1.3造模与给药方法实验第1天，第8天将除空白对照组以外每只大鼠多点注射新鲜配制的0.1%OVA+10%AL(OH)3+生理盐水混悬液共1mL以致敏，空白对照组予以同等剂量生理盐水；造模后第15天开始灌胃，中药治疗组分别给止咳平喘合剂小剂量组7.5g/kg，中剂量组15g/kg，大剂量组30g/kg，阳性对照组给强的松混悬液10mg/kg，空白对照组、模型组给生理盐水10mL/kg，每天1次，连续5天；第17、18、19天给药1h后将大鼠分别置于30cm×30cm×40cm玻璃容器中，模型组、阳性对照组及各中药治疗组均采用1%OVA生理盐水溶液超声雾化，自然吸入20min左右以诱发哮喘，空白对照组用等量生理盐水雾化吸入；以呼吸急促深快，烦燥呛咳，四肢搔抓，点头运动及粪便增多等症状的出现为激发成功；并于最后一次激发后24h将各组大鼠全部处死。
1.4指标检测结扎右侧主支气管，行左侧支气管肺泡灌洗。将收集的BALF摇匀，取200μL加入200μL白细胞稀释液，用血球计数板在普通光镜下计数白细胞，将其余BALF以1200r/min的速度离心10min，沉淀物涂片，HE染色后在400倍放大倍数下，连续数500个细胞并计数嗜酸性粒细胞。取右下肺置于10%中性甲醛溶液固定24h后制作成石蜡组织块和切片，分别行Giemsa染色及免疫组织化学染色，光学显微镜观察哮喘大鼠支气管及肺组织内的炎症变化及Eotaxin表达情况。Eotaxin免疫组化半定量分析方法：在使用Image-ProPlus 6.0图像分析软件对免疫组化Eotaxin的表达采用定量测量积分光密度(IOD)的方法，即：每张切片随机采集3个细支气管，经过该系统自动分析获得该3个视野的细支气管上皮细胞Eotaxin表达强弱的3个阳性细胞积分光密度值，经平均后代表该标本的染色强度，然后进行整理及统计分析。
1.5统计方法采用SPSS 15.0统计软件包进行处理。多组间比较用单因素方差分析，予以方差齐性检验，方差齐性两两比较采用LSD联合SNK法检验，相关性分析采用Spearman检验，所得数据以均数±标准差(±s)表示，以P<0.05作为差异具有统计学意义。
2结果
2.1大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数和EOS计数哮喘模型组、阳性对照组、止咳平喘各剂量组BALF中白细胞总数和EOS数量均显著高于正常对照组，且均有显著性差异(P均<0.01)；与哮喘模型组相比，正常对照组、阳性对照组、止咳平喘各剂量组BALF中白细胞总数和EOS数量均显著降低，均有显著性差异(P均<0.01)；与阳性对照组相比，止咳平喘各剂量组BALF中白细胞总数和EOS数量均显著高于阳性对照组，均有显著性差异(P均<0.01)；止咳平喘各剂量组之间BALF中白细胞总数和EOS数量均无显著性差异(P均>0.05)，见表1。
表1各组大鼠BALF白细胞总数和
EOS计数(n=10，±s)
组别白细胞总数
(×105/L)EOS计数
(×105/L)EOS百分比
(%)正常对照组16.51±0.201.06±0.016.41±0.09哮喘模型组49.65±1.70＃＃10.76±0.13＃＃21.60±1.13＃＃阳性对照组18.48±0.43**＃＃1.25±0.01**＃＃6.73±0.22**＃＃止咳平喘合剂小剂量组22.83±1.16**＃＃1.82±0.02**＃＃8.09±0.38**＃＃止咳平喘合剂中剂量组22.54±0.39**＃＃1.81±0.02**＃＃8.00±0.11**＃＃止咳平喘合剂大剂量组22.25±0.53**＃＃1.81±0.02**＃＃8.13±0.23**＃＃注：与正常对照组相比，＃P<0.05,＃＃P<0.01与模型组相比，*P<0.05,**P<0.01。
2.2各组肺组织Giemsa染色结果及病理形态学观察红细胞呈桔红色，中性粒细胞核呈蓝色，颗粒为紫色，嗜酸性粒细胞核呈蓝色，颗粒呈红色，见插页Ⅷ图1～6。
正常对照组大鼠支气管、肺组织结构清楚，细支气管壁及其周围无明显嗜酸性粒细胞浸润；哮喘模型组大鼠支气管、肺组织结构不清，细支气管黏膜上皮细胞严重坏死、脱落，管壁不光滑，周围组织疏松、水肿，肺泡间隔明显增厚，细支气管壁及其周围可见明显的嗜酸性粒细胞浸润；阳性对照组大鼠细支气管上皮完整，管壁基本光滑，周围组织疏松、水肿不明显，肺泡间隔增厚不明显，细支气管壁及其周围可见嗜酸性粒细胞浸润明显减少；止咳平喘合剂小剂量组大鼠细支气管上皮不完整,管壁不光滑，周围组织疏松、水肿轻度减轻，肺泡间隔中度增厚，细支气管壁及其周围可见少量嗜酸性粒细胞浸润较哮喘模型组减轻；止咳平喘合剂中剂量组大鼠细支气管上皮完整，管壁基本光滑，周围组织中度疏松、水肿，肺泡间隔中度增厚，细支气管壁及其周围可见少量嗜酸性粒细胞浸润较哮喘模型组减轻；止咳平喘合剂大剂量组大鼠细支气管上皮完整 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(2276kb)。