急性肺血栓栓塞溶栓治疗的动物实验研究(2)
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参见附件。
1.2肺栓塞动物模型的制备
1.2.1麻醉动物3%异戊巴比妥钠30mg/kg兔耳缘静脉麻醉后，仰卧位水平固定兔于动物操作台上。行气管插管，连接DW-2000动物人工呼吸机(上海嘉鹏科技有限公司)辅助通气。吸入空气、呼吸频率30次/min、潮气量15mL/kg。
1.2.2置入导管游离左颈动脉和右颈外静脉，经左颈动脉穿刺插入聚乙烯导管留置。经右颈外静脉置入深静脉穿刺管(美国ARROW公司)至肺动脉，导管另一端通过YL-4型压力传感器与SJ-42型四道生理记录仪相连，记录肺动脉压力波。为避免凝血，各管路均间断使用灭菌生理盐水封管。
1.2.3自体血栓制备从颈动脉抽血0.5mL，注入含凝血酶10U的聚乙烯管(直径为1mm)中，放置37℃水浴箱水浴20min。将血栓置于消毒平皿上切成长约3~4mm柱行血栓，用灭菌生理盐水反复冲洗后，记数50个备用。
1.2.4输入自体血栓经深静脉导管注入柱形自体血栓(直径1mm，长度3~4mm)，反复注入使肺动脉收缩压(PASP)维持于40~50mmHg左右，共30min，其后稳定1h。S组输入10mL生理盐水。
1.3观察指标
1.3.1肺动脉平均压(PAMP)测定分别在注栓前、注栓即刻、注栓后2h、溶后1h、2h、4h根据肺动脉压力波计算PAMP。
1.3.2放射性核素肺灌注扫描显像(ECT)分别在注栓后1h及动物处死前由颈外静脉注入99m 锝大分子聚合蛋白(99mTC-MMA)，经肺扫描观察肺部显像。
1.3.3电镜标本制作及观察每组3例，取新鲜肺组织1mm×1mm×1mm2~3块，2.5%戊二醛和1%锇酸常规固定，Epon812包埋，LKB-V型切片机切片，H-600型透射电镜观察。
1.4统计学处理
采用SPSS 17.0软件处理，所有数据均用±s表示，各组间及同组内不同阶段均数的比较用方差分析。
2结果
2.1各实验组溶栓前后的PAMP变化
实验显示注入栓子后C组及UK组的肺动脉平均压(PAMP)与注栓前比较均有明显升高(P<0.01)，UK组在溶栓开始1h后，PAMP即明显下降(P<0.01)，C组PAMP注栓后随时间无显著性变化。S组PAMP在整个实验过程中无明显变化，见表1。
表1各实验组溶栓前后的PAMP变化(mmHg, ±s)
组别n注栓前注栓后2h溶栓后1h2h4hC组611.0±2.829.0±3.7*27.1±4.0*25.8±3.6*25.3±3.8*UK组610.5±2.329.1±3.4*22.9±3.3*★19.0±3.2*★▲16.7±2.4*★▲S组810.4±1.611.1±1.610.9±1.810.6±1.710.5±1.8注：*与注栓前比较P<0.01；★与注栓后2h比较P<0.01；▲与对照组同一时间比较为P<0.01。
2.2放射性核素肺灌注显像
C组：注栓后可见两肺野放射性分布不均匀，有放射性缺损和放射性稀疏现象。UK组：注栓后可见两肺野放射性分布不均匀，左肺中部外侧见放射性缺损，左肺下部、右肺下部见明显放射性稀疏(图1)，溶栓后可见左肺中部、下部及右肺下部明显放射性充填(图2)。S组：右肺面积较左侧稍大，两肺放射性呈生理性分布，肺外带边缘及肺尖部放射性分布稍稀疏，但轮廓完整(图3)。
2.3各实验组肺组织超微结构
S组兔肺组织超微结构正常，肺泡Ⅱ型上皮细胞表面微绒毛丰富，细胞内板层小体较多，毛细血管内皮细胞结构正常(图4)。C组可见肺泡Ⅱ型上皮细胞微绒毛减少，细胞内板层小体数量较多(图5)，血管内皮细胞结构较正常未见明显改变。UK组可见肺泡Ⅱ型上皮细胞脱落，数量较C组明显减少，上皮细胞内板层小体减少，表面平坦，微绒毛极少，线粒体有空泡变性(图6)，内皮细胞可见空泡变性，部分内皮细胞线粒体肿胀，并可见核固缩现象。
3讨论
3.1急性PTE的动物模型
本实验在许俊堂等[1]和梁心平等[2]急性PTE模型建立的基础上加以改进，采用肺动脉内注入凝血酶处理的自体血栓建立兔急性PTE模型。PE动物模型的制备方法可分为两种,即体内血栓形成法和体外栓子注入法。体内血栓形成由于模拟了PTE发病时的血液高凝状态,所以能准确反映机体状况,但PTE形成后血管的复通率、模型的持久性等问题有待进一步研究探讨。体外栓子注入法是将栓子注入体内形成PE模型。文献表明，可用来制作PE模型的栓子很多，包括：血凝块、微粒子、玻璃体、球状物、α-凝血酶、明胶海绵等。最客观、真实、理想的栓子仍是自体血凝块。因为血液在试管内凝固与静脉血栓形成过程相似，即与最易脱落的血栓—红色凝血血栓类似，且PTE的“母血栓”85%来自下肢静脉[3]。然而，由于实验模型缺乏相应的血栓形成的易患因素，自体血凝块的极易溶解和碎裂使其应用受到一定限制。在体外使用凝血酶处理的血凝块，因其很快失活，对体内凝血无影响，形成的血栓接近体内自然形成者，是理想的制备PTE模型的栓子。目前国内外对PTE溶栓前后病理、病理生理变化的研究主要通过结扎或钳夹肺动脉、气囊堵塞肺动脉以及经导管用异物封堵肺动脉的方法制作肺血管缺血再灌注动物模型[4-7]，这些模型虽可明确再灌注时间点，但不能很好反映血栓栓塞时机体的应答状态。
图1S组放射性核素肺灌注显像：右肺面积较左侧稍大，两肺放射性呈生理性分布，肺外带边缘及肺尖部放射性分布稍稀疏，轮廓完整
图2UK组放射性核素肺灌注显像(前位)：注栓后可见两肺野放射性分布不均匀，左肺中部外侧见放射性缺损，左肺下部、右肺下部见明显放射性稀疏。
图3UK组放射性核素肺灌注显像(前位)：溶栓后可见左肺中部、下部及右肺下部明显放射性充填
图4S组电镜下见毛细血管内皮细胞结构正常(×10K)
图5C组电镜下见肺泡Ⅱ型上皮细胞微绒毛减少，细胞内板层小体数量较多(×10K)
图6UK组电镜下见肺泡上皮细胞胞浆疏松，板层小体排空，内质网扩张，线粒体空泡变性(×17K)
本实验利用肺动脉压力控制栓子注入，使各模型组动物血流动力学参数相对保持一致，保证了实验结果的可比性。实验显示，起始栓子注入引起的PAMP升高维持时间很短，很快降至正常，随着栓子不断注入，少量栓子即可引起压力明显升高，维持时间越来越长。实验中UK组有2只兔于栓塞后1h及溶栓后2h死亡，C组有2只兔分别于栓塞后2h及溶栓后3h死亡。尸检发现有肺水肿，气管腔内见大量分泌物，栓子堵塞一侧或两侧肺动脉 ......
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