芪蟾口服结肠靶向片初步药效学研究(2)
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参见附件。
1急性毒性实验
1.1实验材料与方法[1]
1.1.1实验动物动物ICR小鼠，体重18～20g，雌性，清洁级，中国科学院上海实验动物中心/上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物设施合格证SCXK(沪)2007-0005。
1.1.2芪蟾结肠靶向片浸膏制备是由黄芪、生地、蟾皮、苦参等药物组成(5∶3∶3∶3)，Ⅰ黄芪饮片加8倍量70%的乙醇，回流提取2次，每次1.5h，回收乙醇至无醇味，并浓缩至料液比为1∶1；Ⅱ黄芪醇提后的药渣挥干乙醇后与生地合并用6倍量水提取3次，每次2h，合并提取液，浓缩后加入95%的乙醇使含醇量达到70%，静置24h，再重复上述操作1次，取沉淀并挥去乙醇至无醇味；Ⅲ干蟾皮粗粉加10倍量80%的乙醇回流提取2次，每次2h，回收乙醇至无醇味，并浓缩至料液比1∶1；Ⅳ苦参饮片加8倍水提取3次，每次2h，合并水提液，经浓缩后加入95%的乙醇使含醇量达到70%，静置24h，取上清液回收乙醇并浓缩至料液比1∶1。将上述各药(液)混合均匀，4℃冰箱保存，备用。
上述各药材购于浙江中医药大学中药饮片厂、杭州华东医药股份有限公司、安徽亳州药材市场，经浙江中医药大学资源鉴定教研室陈孔荣副教授鉴定真伪及质量合格后供使用。
1.1.3预实验将药物以最大浓度(3.3g生药材/mL)，最大体积0.72mL灌胃给予5只小鼠，观察毒性反应，探讨下一步的实验方法，结果5只小鼠在1h内全部死亡。另将药物以1.65g生药材/mL，0.18mL灌胃给予5只小鼠，观察毒性反应，结果小鼠未出现死亡。根据以上结果，对药物剂量进行调整，找出Dmax(100%致死量的估计值)为59.4g·kg-1和Dmin(0%致死量的估计值)为14.85g·kg-1。Dmax/Dmin为4。据此，确定正式试验分5组，最高给药剂量为59.4g·kg-1，其他各剂量组间间距为0.7。5个实验组的剂量依次为59.4、41.58、29.11、20.37、14.26g·kg-1。
1.1.4LD50的测定动物室温度为(25±1)℃，小鼠先在实验室分笼饲养，每笼10只，所有小鼠适应性饲养3天，观察其活动、饮食、粪便均无异常后，选取50只进行实验。
50只小鼠随机分成5组，每组10只。动物禁食自由饮水9 h后，灌胃，给予不同剂量的药物浸膏。给药当天详细观察给药后动物的反应情况。连续观察7天，记录小鼠的体重变化等。
1.2实验结果及数据处理
芪蟾口服结肠靶向浸膏对小鼠的急性毒性试验，各组动物死亡数及统计结果见表1。各组小鼠死亡多发生在给药后30min至6h内，表现为耳后毛细血管扩张，呼吸急促，肌肉震颤，直至死亡。立即解剖死亡动物，可见胃肠道内有尚未吸收的药液，其余内脏器官未见明显异常。存活动物当天或次日即可进食，观察7天，体重增长，未见其他毒性反应。
表1芪蟾口服结肠靶向片对小鼠的急性毒性
试验各剂量动物死亡率
分组剂量(g·kg-1)n死亡数(只)死亡率(%)159.410990241.5810440329.1110110420.371000514.261000经LD50软件计算，结果表明，芪蟾口服结肠靶向浸膏小鼠口服的半数致死量(LD50)为43.26g/kg。
1.3小结
芪蟾口服结肠靶向浸膏小鼠口服的半数致死量(LD50)为43.26g/kg，人临床用剂量为11g·d-1，此剂量相当于人临床用剂量的19.6倍。
据急性毒性分级标准[2-4]，经口服LD50>15000mg/kg,可视为无毒或基本无毒。本研究所得芪蟾靶向片(浸膏)小鼠口服LD50为43260mg/kg，据此结果可视为该浸膏(芪蟾口服结肠靶向片浸膏)无毒或基本无毒。
2芪蟾结肠靶向浸膏体内抗肿瘤研究
2.1实验材料与方法
2.1.1实验动物ICR小鼠，体重18～20g，雌性，清洁级，中国科学院上海实验动物中心及上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物设施合格证SCXK(沪)2007-0005。
2.1.2瘤株小鼠移植性肝癌(H22)瘤株，由浙江中医药大学动物实验中心提供，Balb/c小鼠传代留种。
2.1.3药物(1)芪蟾消癥汤(临床汤剂组)制备是由黄芪、生地、蟾皮、苦参等药物组成(按临床用药比例)，将上述药材加6倍量水浸泡1h，提取2次，每次1h，过滤，将两次药液合并，浓缩成每毫升相当于原生药材1克(g·mL-1)。4℃冰箱保存。(2)芪蟾结肠靶向浸膏：实验用药按第一部分试验材料与方法中2.1项下制备。上述各药材均购于浙江中医药大学中药饮片厂、杭州华东医药股份有限公司、安徽亳州药材市场，经浙江中医药大学资源鉴定教研室陈孔荣副教授鉴定真伪及质量合格后供使用。(3)5-氟尿嘧啶注射液：5—氟尿嘧啶注射液，批号1011093，天津金耀氨基酸有限公司，10mL：0.25g，用灭菌生理盐水配成2mg·mL-1的使用品，置于4℃冰箱保存。(4)试剂：Mouse TNFα试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司提供；Mouse IFNγ试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司提供；0.01M PBS缓冲液(配法：1000mL蒸馏水加氯化钠8.5g，Na2HPO4 1.4g，NaH2PO40.2g)。
2.1.4实验器材BN1431分析天平，上海民桥精密科学仪器有限公司；RE-5205旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；电热恒温水浴锅，巩义市予华仪器有限责任公司；微量移液器，德国Eppendorf公司；Model 680型全自动酶标仪，购自美国Bio-Rad公司；5804R离心机，德国Eppendorf公司。
2.2实验方法
2.2.1H22荷瘤小鼠模型建立无菌条件下，抽取接种7～10天的，肿瘤生长情况良好的腹水型Balb/c小鼠腹水，加入6倍量的生理盐水，反复冲打，水平震摇以充分混匀。75%酒精消毒小鼠右前肢腋窝部位，每只皮下接种瘤细胞悬液0.2mL。
2.2.2实验动物分组与给药(1)实验动物分组：雌性ICR小鼠60只，入清洁级实验动物室。所有小鼠适应性饲养1天后，随机分为6组，分别为 ：模型对照组；阳性对照组；临床汤剂组；芪蟾靶向浸膏Ⅰ组(低剂量组) ；芪蟾靶向浸膏Ⅱ组(中剂量组)；芪蟾靶向浸膏Ⅲ组(高剂量组) ......
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