氯化钙拮抗马兜铃酸肾毒性的体外观察(2)
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3结果
3.1MTT测定细胞毒性如表1所示，10 mg·L-1AA刺激HKC48h，细胞增殖受抑不明显，随着AA剂量的增加，490nm处OD值(A490)明显降低。用40mg·L-1AA作用于HKC不同时间，490nm处OD值随着培养时间的延长而减低。马兜铃酸肾毒性呈明显的剂量相关性和时间相关性。联用40mg·L -1AA和CaCl2刺激HKC48h的实验发现：CaCl2能减弱AA毒性，以600μmol·L-1最明显(P<0.05)。
表1AA抑制HKC增殖的量效关系和时效关系及
CaCl2对AA毒性的影响(n=6,±s)AA
(mg/L)A490AA40mg/L-
Time(h)A490AA40mg/L+
CaCL2A49000.831±0.134120.785±0.10600.492±0.076100.795±0.134△240.561±0.031▲3000.502±0.099200.672±0.021△480.492±0.076▲6000.631±0.123★400.492±0.076△720.322±0.126▲12000.628±0.065★注：△P<0.05,与AA0mg/L组比较;▲P<0.05,与AA40 mg/L-12h组比较;★P<0.05，与AA40 mg/L+CaCl2 0组比较。
3.2流式细胞仪测定细胞周期的改变如图1所示，1mg·L-1AA作用细胞48h，G0/G1期细胞明显减少，S期和G2/M期细胞增多，统计学有显著性差异。随着AA剂量的倍增，S期细胞越来越多，G2/M期细胞越来越少。然而，AA浓度高达AA40mg·L-1时，G0/G1期细胞增多，S期细胞减少。图2为20 mg/L AA作用于细胞 12h、24h、48h和 72h后的细胞周期变化。随着作用时间的延长，S期和 G2/M期细胞所占比例越来越多(P<0.05)。本文选用10mg/LAA作为观察CaCl2作用的实验浓度，结果发现CaCl2一定程度上可逆转10mg·L-1AA的毒性，以600μmol·L-1最为明显，见图3，表现为S期细胞明显减少，G2/M期细胞明显增多。
图1AA阻滞细胞周期的量效关系图220mg/LAA阻滞细胞周期的时效关系图3CaCl2对AA10mg/L的逆转作用4讨论
目前认为[4]，马兜铃酸肾病的发病机制有：肾小管上皮细胞的坏死或凋亡、肾小管上皮细胞转分化和肾间质成纤维细胞增生或活性增高等。近年有研究发现，银杏叶提取物[5]等可减轻大鼠慢性马兜铃酸肾病的病变。磷脂酶A2在该病中的重要地位，尚未得到重视。
磷脂酶A2(PLA2)是一类可分解甘油磷脂的酶类家族。PLA2激活后促使血小板因子(PAF)、前列腺素类、凝血氧烷和白三烯等多种脂类介质的生成与释放，引起炎症级联反应。PLA2则是此类反应的限速酶，尤其是sPLA2[6]，在炎症病理过程中处于关键性的环节。钙离子是它的激活剂。氯化钙是常用的sPLA2激活剂。通过转基因技术发现[7]，过度表达sPLA2的鼠肾成纤维细胞表现出明显的抗凋亡功能，加入sPLA2抑制剂(包括马兜铃酸)，则发生大量凋亡。马兜铃酸[8]及其他sPLA2抑制剂还可剂量相关地抑制子宫基底层细胞的增殖。这些都提示sPLA2具有促增殖和抗凋亡的功能。本研究前期结果提示[3]，AA可抑制激sPLA2活剂对HKCsPLA2的激活。在此基础上，本文进一步观察了氯化钙能否改善马兜铃酸毒性。
文中MTT结果表明，马兜铃酸肾毒性呈明显的剂量正相关和时间正相关，20mg·L-1AA可引起490nm处OD值下降，40mg·L-1AA组则明显减低，同文献报告一致[9]。如果将40mg·L -1AA和不同浓度的CaCl2共同培养HKC，MTT490nm处OD值则有所改善，特别是600μmol·L-1(P<0.05)。
本研究用1mg·L-1AA作用HKC48h后，细胞阻滞主要发生在S期，且随药物浓度增加而加剧。国内学者[10]用160～1280 ng·mL -1AAⅠ(中国药科大学天然药品化学教研室，纯度90%)刺激LLC-PK1 24h，细胞被阻滞在G2/M期。本文所用AA主要为AAⅡ(占65%)，因此推测，将HKC主要阻滞在S期，可能是AAⅡ的作用，也可能与用药剂量和细胞种属不同有关。本文还观察到，G2/M期细胞
收稿日期：2011-10-11
基金项目：沈阳市科技局资助项目(1081238-1-00)
作者简介：郭丹萍(1982-),女，学士，研究方向：流感疫苗的生产及质量检测。
通讯作者：李峰(1963-),女，天津人，教授，博士研究生导师，研究方向：动物药材品质评价。随药物浓度而减少，可能与剂量加大导致G2/M期细胞死亡或凋亡有关。随培养时间延长，20mg·L-1AA组细胞中G2/M期和S期细胞都呈增多趋势，但仍以S期为主，G2/M期细胞增多的具体机制尚待进一步研究。
与单用40mg·L-1AA组相比，联用40mg·L-1AA 和CaCl2后，490nm处OD值轻度上升，以或600μmol·L-1CaCl2最明显，其中后者的作用有统计学意义。在此前提下，本文选用该浓度来观察对细胞周期的影响。10mg·L-1AA联用或600μmol·L-1CaCl2，可轻度改变PCNA的表达，以后者为著。10mg·L-1AA联用CaCl2后，S期细胞逐渐减少，G2/M期细胞逐渐增多，G0/G1有下降趋势，尤其是600μmol·L-1CaCl2，表明CaCl2可促进S期细胞进入G2M期细胞，从而改善S期阻滞的状况。总而言之，关于PLA2激活剂氯化钙和马兜铃酸肾毒性的相关研究极少，本文的结果提示，该方面值得进一步研究。
参考文献
[1]吴杰，陈香美，师锁柱.急慢性马兜铃酸肾病的临床病理特点及其病理机制[J].中华检验医学杂志，2005,28(6): 587-590.
[2]Yang HC, Mosio M, Johnson CA, et al. Group-specific assay that distinguish between the four major types of mammalian phospholipase A2[J] ......
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