榄香烯对人胃癌细胞SGC-7901的体外生长及CD44v6、CD44的影响(2)
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参见附件。
1.2.4榄香烯对胃癌细胞表面黏附分子CD44、CD44v6的影响 在6孔培养板中每孔接种2×105个SGC-7901 细胞，24 h后分别加入0、10、20、30、40μg/mL 榄香烯，各浓度均设5个复孔，继续培养24 h，收集细胞，PBS 洗2 次，胰蛋白酶消化成单细胞悬液，PBS洗2次，分成2管，各加入CD44v6 FITC /CD44 PE，mouse IgG1 FITC/mouse IgG1 PE各5μL，室温避光孵育20 min，PBS洗2次，离心后沉淀加200μL，重悬上机检测，获取和分析均采用CellQuest 3.2软件处理。
1.3统计学处理
不同药物浓度组间的比较采用完全随机设计的方差分析，各药物浓度组与对照组的比较采用Dunnett t检验，以α= 0. 05为检验水准，采用SPSS 17. 0数据分析系统。
2结 果
2.1 榄香烯抑制SGC-7901细胞增殖
与不加药对照组相比较，不同浓度榄香烯在加药后24h、48 h、72 h后均对SGC-7901细胞有明显抑制作用，并呈现时间及浓度依赖性，结果见表1
2.2榄香烯诱导SGC-7901细胞凋亡
未经榄香烯处理的SGC-7901细胞，核膜光滑、核质均一；48h后10μg/mL组与未加药组相比较，细胞内部分染色质出现浓缩， 20μg/mL组的细胞体积缩小，染色质高度浓缩、边缘化；30μg/mL组与40μg/mL组的细胞明显凋亡，可见细胞核碎裂和凋亡小体。见图1。
2.3 榄香烯降低SGC-7901细胞CD44v6表达
不同浓度的榄香烯作用于SGC-7901细胞24 h后，CD44v6表达率均小于不加药对照组，其中20、30、40μg/mL组与对照组的差异显著(P<0.01)，且呈现剂量依赖性。但不同浓度组CD44的表达率与不加药对照组的差别无统计学意义(P >0.05)，见表2。
3 讨 论
胃癌是临床常见的恶性肿瘤，目前治疗手段以手术联合细胞毒化疗药物为主，而化疗对重要器官的损伤和肿瘤耐药是临床经常遇到的难题。榄香烯作为Ⅱ类非细胞毒性抗肿瘤药，具有化疗增敏、逆转肿瘤多药耐药和提高机体免疫功能的作用，且不良反应轻微，因而在胃癌的临床治疗上有良好的应用前景。
本实验采用CCK-8法检测榄香烯对胃癌细胞SGC-7901增殖的抑制作用，结果显示，10μg/mL榄香烯对SGC-7901细胞的增殖开始出现抑制作用，存在量效和时效关系，即药物剂量越大，抑制作用愈明显，药物剂量相同时作用时间越长，抑制增殖效果越明显。DAPI荧光染色进一步从形态学上证明榄香烯能诱导SGC-7901细胞凋亡，荧光显微镜下可见细胞核内的染色质呈高度浓缩、边缘化，产生细胞核碎片，形成凋亡小体。
榄香烯在抗肿瘤细胞浸润、迁徙和转移方面的作用已被大量研究证实，如郑瑾等[5]发现榄香烯能降低人肝癌SK-hep-1细胞中基质金属蛋白酶-2 (MMP-2) mRNA的表达，从而降低肝癌细胞的侵袭、迁移能力，陶磊等[6]通过实验表明榄香烯通过抑制bFGF、VEGF表达从而抑制肿瘤血管生成，李秋营等[8]进一步发现榄香烯通过下调胃癌移植瘤突变型p53表达，从而抑制胃癌组织VEGF介导的血管生成。
为了进一步研究榄香烯抗胃癌细胞转移的可能机制，本实验采用流式细胞仪分别检测榄香烯处理组和对照组细胞表面黏附分子CD44、CD44v6的表达。CD44是一种分布极为广泛的细胞表面黏附分子，主要参与细胞与基质间的黏附,且参与细胞的伪足形成,与细胞的迁移有关[7]。而CD44v6是黏附分子CD44的一种拼接异构体，正常组织细胞或非转移的癌细胞主要表达CD44s，而具有转移能力的癌细胞主要表达CD44v。Yamamichi等[9]发现在73例胃癌患者中，有淋巴结转移或肝转移者CD44v6mRNA的表达水平明显高于没有转移者, 并发现低表达的病人较高表达者有更长的生存期, 认为CD44v6可作为判断胃癌患者淋巴结转移和预后的指标。CD44v6促进浸润、转移的机制可能为(1)与透明质酸(HA)结合, 通过HA发挥促进肿瘤转移的作用；(2)CD44v6使肿瘤细胞模仿淋巴细胞归巢过程；(3)影响细胞内骨架蛋白的构像和分布, 改变肿瘤细胞的运动能力；(4)肿瘤细胞表达CD44变异体可以在转移过程中逃避宿主免疫系统的识别而免于被清除[10]。本实验显示榄香烯作用胃癌SGC-7901细胞24h后，能明显下调细胞表面CD44v6的表达，且呈剂量依赖性，但CD44表达的差异无统计学意义，表明榄香烯抑制胃癌细胞的浸润及转移的机制可能与降低CD44v6的表达率有关。
综上所述，本研究表明榄香烯对胃癌SGC-7901细胞具有抑制增殖、促进凋亡和抗转移的作用，其抗转移作用可能与降低细胞表面CD44v6的表达有关。
参考文献
[1] 汤秀红,秦叔逵,谢恬.榄香烯抗肿瘤作用基础研究的现状和进展[J].临床肿瘤学杂志, 2010,15(3):266-273.
[2]杨道科,宋一帆. β-榄香烯对人肝癌细胞株的体外放射增敏作用[J].中国现代药物应用, 2008,2(17):47-49.
[3]胡军,金伟,杨佩满. β-榄香烯逆转人乳腺癌MCF-7/ADM细胞对阿霉素耐药性的研究[J].中华肿瘤杂志, 2004(5):15-17.
[4]官成浓,何国章,银正民.榄香烯乳配合化疗对进展期胃癌患者免疫功能的影响[J].中国肿瘤临床, 2001, 28 (2):123.
[5]郑瑾, 刘强, 任凯夕, 等. β-榄香烯对肝癌细胞SK-hep-1的迁移和侵袭力的影响[J]. 现代肿瘤医学, 2009,17 (11):2054-2058.
[6]Tao L, Zhou L, Zheng LY, et al. Elemene disp lay anti-cancer ability on laryngeal cancer cells in vitro and in vivo [J] ......
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