β-榄香烯联合高温对肺腺癌A549细胞作用的实验研究(2)
 |
| 第1页 |
参见附件。
各组细胞经上述处理后，换用新鲜培养液，继续25mL的培养瓶37℃、5%CO2孵箱中常规培养24h后，收集细胞，PBS洗2遍，再用70%预冷4℃乙醇固定保存过夜，按常规的PI染色方法检测，FCM分析，并用软件分析各时相细胞的比例。
1.2.4A549细胞形态学观察A549细胞按实验分组，分别进行相应的处理，细胞收集上清液并离心，将瓶底细胞用胰酶+EDTA消化并离心，两者合并后计数，细胞数在100万～263万，0.2M PBS冲洗2次后，以2.5%戊二醛固定，保存4摄氏度，0.1M PBS冲洗15min两次，1%锇酸后固定1h，0.1M PBS冲洗15min两次，2%醋酸铀水溶液染色30min，50%、70%、90%酒精依次脱水15min，100%酒精脱水20min，100%丙酮脱水20min，1∶1渗透：无水丙酮与包埋剂1∶1(V∶V)混合渗透组织，震荡2h，纯包埋剂渗透组织，震荡1.5h，纯包埋剂包埋，置烘箱中聚合37摄氏度24h，45摄氏度24h，60摄氏度48h，修块，超薄切片120nm，超薄切片染色：4%醋酸铀染色20min，枸橼酸铅染色5min，Tecnai 10透射电镜80kv观察。
1.2.5统计学处理应用SPSS 11.0统计软件，计量资料用±s表示，两组间采用t检验；多个治疗组间采用方差分析法，并进行SNK-q检验，检验水准α＝0.05。
2 实验结果
2.1 加热或未加热A549细胞对榄香烯敏感性的改变
在15μg/mL、30μg/mL、60μg/mL和125μg/mL榄香烯浓度下42℃作用1.5h，A549细胞株的抑制率要高于未加热常规培养的细胞,但只有60μg/mL浓度榄香烯组细胞抑制率差异具有统计学意义(P=0.002)。而250μg/mL和500μg/mL榄香烯浓度下未加热组细胞抑制率反而略高于加热组，但无统计学差异(P>0.05)。细胞与不同浓度的榄香烯作用后，其抑制率分别见表1和图1；计算出半数抑制浓度(IC 50)分别为35.43μg/mL和28.68μg/mL。
2.2 榄香烯和高温对A549细胞周期的影响
各组细胞经不同处理后分别继续常规培养24h后，FCM分析细胞周期中各期比例分别见表2。单纯榄香烯或与高温联合处理后细胞周期均出现明显改变，G0-G1期细胞比例增高，而S期细胞所占比例显著降低(P<0.01)。
3 讨 论
热疗是肿瘤治疗的重要手段之一，而肿瘤细胞在受到热冲击的情况下,会出现热耐受现象，从而降低肿瘤细胞对热化疗的敏感性。这与热疗诱导产生的热休克蛋白(HSP)高度相关。β-榄香烯是从中草药莪术中提取的一种抗肿瘤药物，有研究显示其具有诱导细胞凋亡、下调Bcl-2基因表达等作用[2]，另外李道睿等[3]发现榄香烯还能显著下调与侵袭转移相关的黏附蛋白血小板免疫相关抗原CD42a和TSP的表达，从而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移，且不良反应小,安全性好。文献报道证实,在体外实验中榄香烯对耐阿霉素的人肝癌细胞株BEL-7402/ DOX细胞仍有较强的杀伤作用,不易产生多药耐药性[4]。金梅等[5]的研究表明榄香烯和热休克复合处理使L615白血病细胞凋亡数显著增加，并呈榄香烯浓度和热休克温度、时间依赖性。
本实验中榄香烯对A549细胞株的抑制率在37℃及42℃加热组也表现为剂量依赖性，并且低浓度时加热组细胞抑制率曲线要高于常温组，在榄香烯浓度为60μg/mL时加热组抑制率显著高于常温组(P=0.002)。但随着榄香烯浓度的增高，两组细胞抑制率曲线接近重合。显示加热联合榄香烯对A549细胞的协同杀伤作用只有在低浓度时存在，超过一定的浓度，其协同作用消失。
低浓度榄香烯联合热疗的协同作用机制还不清楚。有文献报道β-榄香烯能阻滞HeLa细胞在G2+M期,并降低肿瘤细胞分裂能力,抑制其增殖[6]。而Atallah等[7]发现热疗和奥沙利铂(oxaliplatin)联合作用于两株结肠癌细胞Caco-2和HT-29后，出现G1/S期阻滞现象。为了进一步了解榄香烯联合加热对A549细胞株的作用，我们选择了榄香烯(15μg/mL)、榄香烯(60μg/mL)和加热42℃3个处理因素对细胞株进行不同联合的处理。结果显示榄香烯和高温单独处理或联合作用后各组细胞出现不同程度的凋亡。除对照组外S期细胞比例均显著降低，并且G0/G1期细胞所占比例较对照组明显增高。在细胞周期时相中，S期细胞对热杀伤最为敏感，因此高温联合榄香烯的协同作用最有可能表现在选择性杀伤S期细胞上，而诱导细胞凋亡也是其主要的作用之一。另外高温和榄香烯也可能通过抑制细胞增殖过程中的某些周期调控因子，最后导致G1/S期阻滞现象，诱发细胞凋亡。高温和β-榄香烯诱导肿瘤细胞凋亡的机制还不十分清楚。目前主要的观点是通过下调Bcl-2、Survivin基因，上调BAX基因表达等途径来诱导凋亡的[8-9]。
G1/S点是人类细胞增殖周期中至关重要的限速位点，调节G1/S期转化的调控因子主要为细胞周期素D和E(cyclinD、cyclinE)、细胞周期素依赖激酶(cyclin-dependent kinase)以及CDKs的抑制因子(Cyclin dependent kinase inhibitors)。文献报道榄香烯和高温均能上调P21WAF1/Cip蛋白的表达[10-11]。P21WAF1/Cip是一种细胞周期素依赖性激酶的抑制蛋白(CDKs抑制因子)，它可以通过结合抑制细胞周期素依赖性蛋白激酶如CyclinE-CDK2,CyclinE-CDK4及CyclinD-CDK4的活性来控制G1/S控制点，使肿瘤细胞出现G1/S期阻滞和凋亡[12]。本实验在细胞水平已经观察到低浓度榄香烯与高温联合对A549细胞周期改变和细胞毒性具有协同作用，相关的分子作用机制有待进一步的研究。
参考文献
[1] 金梅，胡景慧，吴志华，等.榄香烯或/和热休克对肿瘤细胞凋亡的影响[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2003，10(2):133.
[2] 邹丽娟，刘伟先，于丽敏，等.β-榄香烯诱导K562白血病细胞凋亡[J].中华肿瘤杂志,2001,23(3):196-198.
[3] 李道睿,祁鑫,于明薇,等.榄香烯对人肺癌细胞表面所表达与侵袭转移相关黏附蛋白的影响[J].，2007，25(10):2170-2172.
[4] 王宝成,郭军,狄剑时,等. 榄香烯乳剂与肿瘤多药耐药的基础研究[J].中国肿瘤临床,1996,23(2) :143–146.
[5] 金梅，胡景慧，吴志华,等.榄香烯或/和热休克对肿瘤细胞凋亡的影响[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2003，10(2):133.
[6] 马东礼，肖家祁，童善庆，等.榄香烯诱导Hela细胞凋亡的实验研究[J].上海第二医科大学学报,2000, 20 (6):484-487 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(2493kb)。