乔松素在大鼠体内外代谢产物的UPLC-MS/MS鉴定(2)
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参见附件。
取胆汁200μL，置于已处理好的C18固相小柱上，先用2mL纯净水洗脱，继用3mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，40℃氮气吹干，残渣以300μL30%的甲醇复溶并转移到离心管中，20000r/min离心10min，吸取上清液进样分析。大鼠空白胆汁样品同法处理。
2.3色谱条件
Acquity UPLC BEH C18柱(2.1mm×50mm,1.7μm美国Waters公司)；Van Guard BEH C18，1.7μm预柱(美国Waters公司)；柱温45℃；流动相为A(0.1%甲酸)和B(乙腈)，梯度洗脱见表1；流速：0.3mL/min；进样体积：5μL。
2.4质谱条件
电喷雾离子源(ESI)，正离子方式，毛细管电离电压:3kV,锥孔电压:40V，萃取电压:2V,离子源温度:120℃，去溶剂气温度:400℃，喷雾气:氮气，去溶剂气流速:500L·h-1，锥孔气流量:50L·h-1，碰撞气为氩气，碰撞气流速：0.15mL/min。质谱扫描方式采用全扫(massscan)，子离子扫描(daughter scan)和选择离子监测(SIR)。
2.5 肝微粒体孵育体系
2.5.1 肝微粒体Ⅰ相反应孵育体系 大鼠肝微粒体0.5mg/mL，D-glucose-6-phosephate(10mM)、D-glucose-6-phosephate dehydrogenase(1unit/mL)，MgCl2(4mM)，Phosephate buffer(100mM，pH=7.4)，NADP+(1mM)，乔松素(20μM)，总体积200μL，其中有机溶剂体积小于1%。设反应组，阴性组(NADP+以buffer代替)和空白组(底物以甲醇代替)。反应从加入NADP+开始， 37℃孵育30 min，加入冰冷乙腈100μL，冰浴中止反应。20000r/min离心10min，取上清液，进样分析。
2.5.2 肝微粒体Ⅱ相反应孵育体系 大鼠肝微粒体0.5mg/mL，MgCl2(4mM)，Brij(0.05mg/mL)，Tris-HCl(50mM,pH=7.4)，UDPGA(5mM)，乔松素(20μM)，总体积200μL，其中有机溶剂体积小于1%。设反应组，阴性组(UDPGA以buffer代替)和空白组(底物以甲醇代替)。将肝微粒体0.5mg/mL与Brij(0.05mg/mL)混匀，预孵3min，反应从加入UDPGA开始，37℃孵育30min，加入冰冷乙腈100μL，冰浴中止反应。20000r/min离心10min，取上清液，进样分析。
3 结 果
3.1 乔松素及其代谢产物的质谱裂解规律
乔松素易发生碳1,3和碳1,4断裂，正离子模式下，其准分子离子为[M+H]+m/z257，二级质谱中，A环主要裂解碎片为m/z153、m/z97，B环主要裂解碎片为m/z131、m/z103。乔松素的Ⅰ相羟基代谢产物，其准分子离子为[M+H+16]+m/z273，若羟基化发生在A环，其A环裂解碎片增加16，为m/z169、m/z141(m/z169-CO)，若羟基化发生在B环，其B环裂解碎片增加16，为m/z147、m/z119。乔松素的Ⅱ相葡萄糖醛酸化代谢产物，其准分子离子为[M+H+176]+m/z433，其二级质谱主要碎片离子为m/z257、m/z153、m/z131和m/z103。
3.2 代谢产物的UPLC-MS/MS分析
3.2.1 乔松素在大鼠肝微粒体中代谢产物的分析 采用UPLC-MS/MS联用法对乔松素大鼠肝微粒代谢反应组进行分析，并与空白组、阴性组、柚皮素对照品进行对照。在大鼠肝微粒体Ⅰ相代谢孵育体系中，检测到m/z273的代谢产物M1、M2、M3，见图1。在大鼠肝微粒体Ⅱ相代谢孵育体系中，检测到m/z433的代谢产物M4，见图2。在孵育体系中都检测到了乔松素原型m/z257。
3.2.2 乔松素在大鼠体内代谢产物的分析 通过与空白胆汁比较，在不同时间段收集的大鼠胆汁中检测到两个m/z433的Ⅱ相代谢产物，见图3。通过比较保留时间和二级质谱主要碎片离子，确定其中一个为M4。另一个编号为M5。在0～6h的大鼠胆汁中检测到乔松素原型，其含量随时间下降，8h后已检测不到，说明其基本代谢完全。
(A.空白胆汁m/z433；B.给药后胆汁m/z433；C.给药后胆汁m/z257)
图4 胆汁中代谢产物的选择离子流色谱图
通过与空白尿液样品比较，从给药后尿样中检测到3个代谢产物。比较保留时间和二级质谱主要碎片后，确定这3个代谢产物分别为M2、M4和M5，见图4。在给药24h后的尿样中仍能检测到M2和乔松素原型，但未检测到M4和M5。
(A.空白尿液m/z273；B.给药后尿液m/z273；C.空白尿液m/z433；D.给药后尿液m/z433；E.给药后尿液m/z257)
图5 尿液中代谢产物的选择离子流色谱图
通过与空白粪便样品比较，从给药后粪便样品中检测到2个代谢产物，比较其保留时间和二级质谱碎片后，确定其分别与M2和M4，见图5。在给药24h后的粪便样品中仍能检测到乔松素原型和少量M4，但未检测到M2。
3.3 代谢产物的鉴定
M1、M2的准分子离子[M+H]+为m/z273，比原药乔松素多16。二级质谱主要碎片离子均为m/z153、m/z147、m/z119、m/z97。他们的A环碎片与乔松素相同，B环碎片离子m/z147、m/z119比乔松素B环碎片离子m/z131、(A.空白粪样m/z273；B.给药后粪样m/z273；C.空白粪样m/z433；D ......
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