扶正固本中药对急性肺损伤大鼠免疫调节作用研究(2)
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1 材料与方法
雄性SD大鼠，体重(200±10)g，30只(由浙江中医药大学动物实验中心提供)。实验药物：脂多糖(LPS，美国sigma公司)；黄芪注射液(10mL/支，成都地奥九泓制药厂)；参附注射液(10mL/支，雅安三九制药有限公司)；卡介菌多糖核酸注射液(0.5mg/1mL，湖南九芝堂公司)。主要试剂和仪器：IFN-γ、IL-4 ELISA试剂盒(深圳晶美生物公司)；酶标测试仪(芬兰Labsystems公司)； GL-7000型全自动生化分析仪(日本岛津公司)；FA2104电子分析天平(上海天平仪器厂)；OLYMPUSBX50型万能纤维镜(日本OLYMPUS公司)；德国BECKMAN CS-15R Centrifuge离心机(德国BECKMAN 公司)三高CMIAS98B型多功能彩色计算机病理图象分析系统(北京航空航天)。
2 实验方法
大鼠30只随机分成5组：(1)正常对照组：6只，每天予以生理盐水2mL/只腹腔注射，共7天。(2)急性肺损伤组：6只，每天予以生理盐水2mL/只腹腔注射，共7天。(3)黄芪组：6只，每天予以黄芪注射液1mL/只腹腔注射，共7天。(4)参附组：6只，每天予以参附注射液1mL/只腹腔注射，共7天。(5)黄芪+参附组：6只，每天予以黄芪及参附注射液各1mL/只腹腔注射，共7天。实验的第7天常规给药后于当晚造模：除正常对照组外，其余4组均以LPS5mg/kg尾静脉注射；正常对照组予以等量生理盐水尾静脉注射。造模12h后，各组大鼠予以3%戊巴比妥钠(浓度：30μg/mL)腹腔注射45mg/kg[9mg/(200g·0.3mL)]。鼠板固定，常规消毒，腹主动脉抽采血10mL，分离肺组织，右肺4叶剪开，2叶置于10%甲醛中固定做病理切片，2叶置于冻存管中保存。右肺中叶10%甲醛固定，逐级酒精脱水，石蜡切片，HE染色。左肺3mL×3次行支气管肺泡灌洗，血与灌洗液离心后(5000r/min，4℃5min)取上清液，置于-20℃冰箱中保存备检。
3 肺损伤的定级
根据文献[1]确定肺损伤的分级，光镜下观察肺组织病理变化，观察肺泡、间质炎性改变、出血和肺水肿的程度。每种改变以0~3级评分(正常0分、轻度改变1分、中度改变2分、重度改变3分)，以每组标本的均值作为该组的肺损伤评分。计算肺系数(肺湿重/体重×100%)、BALF中蛋白含量。
4 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件包进行统计，计量资料数据以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析(one way ANOVA)。以 P < 0.05为差异显著，以 P <0.01为差异非常显著。
5 结 果
5.1 病理组织学观察 光镜观察显示ALI组大鼠肺间质弥漫性出血,肺泡腔内大量红细胞渗出和炎症细胞浸润，部分切片可见灶状肺不张，透明膜形成。中药治疗各组肺间质及肺泡毛细血管扩张、出血炎症细胞浸润程度均减轻。各组肺损伤评分均值：ALI组(3.0分)显著高于NS组(0.3分)。HQ组(1.5分)，SF组(1.7分)，HQ+SF组(1.5分)较ALI组明显减低。P<0.05，见插页Ⅴ图1。
5.2 肺损伤各指标变化情况 由表1可知，内毒素可造成明显的肺部损伤，ALI组肺系数及BALF中的蛋白含量较其它组明显增高，HQ组、HQ+SF组、SF组的两项指标较ALI组均有所下降，其中HQ+SF组下降更为明显，可见其对急性肺损伤有较好的保护作用。
5.3 BALF中IFN-r、IL-4的含量 与正常对照组比较，肺损伤组大鼠BALF中IFN-γ含量明显减少(P<0.01)，IL-4含量明显增加(P<0.01)。与肺损伤组比较，黄芪组IFN-γ含量明显增加(P<0.01)，参附组IFN-γ含量无明显变化(P>0.05)，黄芪加参附组IFN-γ含量较肺损伤组、黄芪组、参附组明显增加(P<0.01)。各组IL-4含量较肺损伤组无明显变化(P>0.05)。见表2。
5.4 血液中IFN-r、IL-4的含量 与正常对照组比较，肺损伤组大鼠血液中IFN-γ含量明显减少(P<0.01)，IL-4含量明显增加(P<0.01)。与肺损伤组比较，黄芪组IFN-γ含量明显增加(P<0.01)，参附组IFN-γ含量变化不明显 (P>0.05)，黄芪加参附组IFN-γ含量较肺损伤组、黄芪组、参附组明显增加(P<0.01)。各组IL-4含量较肺损伤组无明显变化(P>0.05)。见表3。
6 讨 论
目前实验证明ALI时存在着TH1向TH2漂移[2]。而Th1/ Th2漂移的方向及程度在一定程度上影响急性炎症反应发展的速度与转归。TH1/TH2失衡与中医本质有着一定关系，一些学者提出中医证的本质是细胞因子，认为其基本发病机制是由于细胞因子网络的平衡紊乱[3]。Th1/Th2失衡参与气道炎症反应,是风寒乘虚犯肺证形成的重要物质基础[4]。中医辨证首辨实证与虚证：疾病初期正气未衰，邪正相争，表现为实证；中后期正气渐衰，邪气入内，表现为本虚标实；疾病晚期或大伤气血津液，阳损及阴或阴损及阳，阴阳失衡致亡阴亡阳，表现为一派虚象。目前认为MODS免疫抑制阶段存在急性虚证，它与中医传统理论“久病多虚”的虚证不同，是致病因素导致机体短时间内出现阴阳、气血、脏腑功能迅速虚衰的证候[5]。对于急性虚证严重免疫抑制的患者仅降低促炎细胞因子是不够的，还应该全面调理其免疫功能，选用相应的方药进行扶正固本治疗，主动调节宿主防御反应，恢复机体内环境的动态平衡，即恢复传统中医强调的“内稳态”的平衡，应当是中西医结合治疗急性危重病思路和方法的方向。
参附注射液是从《正体类要》的参附汤转化而来。参附注射液主要成分为红参和附片，可回阳救逆，益气固脱。主要用于阳气暴脱的厥脱症(感染性、失血性、失液性休克等)； 本实验观察到HQ、SF、HQ+SF组肺病理结果显示肺损伤程度明显减轻，说明黄芪注射液、参附注射液、黄芪+参附注射液对急性肺损伤都有防治作用。观察BALF及血液中IFN-γ、IL-4，发现与ALI组比较，HQ组有明显提高IFN-γ水平的作用，单独使用SF组IFN-γ、IL-4与ALI组比较均无统计学意义，但病理提示肺损伤有改善，提示参附注射液通过其他途径防治肺损伤。HQ+SF组IFN-γ水平较HQ、SF、ALI组明显升高(P<0.01)，考虑与中药有效成分较复杂、作用多靶点、各种中药配伍产生不同效果有关。各组IL-4水平与ALI组比较无统计学意义，提示这几组扶正固本的中药对抗炎因子无明显作用，仅通过增强TH1细胞因子而影响TH1/TH2平衡。本实验中我们提前一周预防性给药体现了中医药把预防、保健、养生融于一体的“治未病”传统精神，对有倾向的易感人群预防性使用扶正固本的中药调理，对防止急性肺损伤发生、减轻损伤发生后的程度有明显作用。观察发现 SF组BALF及血液中IFN-γ、IL-4含量，与ALI组相比无显著差异 ......
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