龙血竭对大鼠肺损伤间质过度修复及其TGFβ1mRNA表达的影响(2)

http://www.100md.com 2012年4月1日 杨礼腾 刘欣 程德云 方洵 穆茂 胡晓波 聂莉

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    参见附件。

     肺损伤后炎症损伤信号的进一步放大及肺实质与间质的修复情况直接影响到病情的转归，而肺实质与间质修复失衡致间质过度修复，使细胞外基质过度沉积将导致肺间质纤维化，TGFβ1是主要由肺实质细胞合成分泌而作用于成纤维细胞为主的间质成分，促进肺间质修复目前已知的对胶原合成最直接和有效的刺激剂，也是调控肺间质过度修复而防治肺纤维化的关键靶点，已有研究证实[1]，中药提取物龙血竭具有下调II型TGFβ受体(TGFβRII)及smad4mRNA的表达阻断TGFβ-Smads信号转导而抗肺钎维化的作用，但对肺损伤后的炎症反应、间质过度修复及TGFβ1mRNA表达的影响目前报道较少。

    1材料和方法

    1.1 主要材料

    ①FTC-2000型荧光定量基因扩增仪(加拿大枫岭公司)，美国Image-pro plus专业图像分析软件系统(美国Media Cybernetics公司)。②博来霉素(批号Y32480日本化药株式会社)。③TaqDNA聚合酶和dNTP(立陶宛MBI公司)，引物探针(上海生物工程有限公司)，Trizol(美国MRC公司)。④健康SD大鼠60只，150～250g，6～7周龄，雌雄各半(四川大学华西实验动物中心提供)。⑤龙血竭(粉末)(云南云河药业有限公司生产，批号040147080)。

    1.2方法

    1.2.1动物分组、肺损伤修复模型的建立[2-3]及标本的收集

    ①健康SD大鼠60只，实验条件下饲养一周后，先按性别分层并随机分为生理盐水组(NS)﹑博莱霉素肺损伤组(BLM)及龙血竭组(LXJ)，每组20只，再据14天28天两时相再分成两亚组，每亚组雌雄各5只。②大鼠称重后，予速眠新II(1mL/kg体重)大腿外侧肌注麻醉并固定于鼠台上，无菌操作下于颈前正中切开皮肤2～3cm，钝性分离至气管，用7号针头连1mL注射器，于气管环间刺入气管后平行进气管，将针头斜面对着气管前壁缓慢滴入博来霉素(5mg/kg体重)，然后缝合切口，将大鼠直立旋转使药液于肺内分布均匀，放回笼中正常饲养，并从即日起，BLM组每天灌胃生理盐水3mL，而 LXJ组，从第2天起，每天予龙血竭(180mg/kg，溶于3mL生理欲水中)灌胃。③NS组气管内滴入生理盐水0.2～0.3mL，并每天灌胃生理盐水3mL；所有大鼠分别于第15和29天早上8-9点速眠新II麻醉下于腹主动脉放血致死并取标本，先称肺重后用4%多聚甲醛灌注左肺后剪下左肺下叶于4%多聚甲醛中固定，同时剪右肺下叶用无菌锡薄纸包裹后于液氮罐中速冻后液氮罐中保存备用。④在文献方法[2-3]的基础上，从肺组织病理改变﹑胶原染色定量等方面对肺损伤修复模型进行鉴定。

    1.2.2 组织芯片的制作及相关指标的检测

    (1)制作：肺组织于4%多聚甲醛中固定8h后制成蜡块，并将28天BLM组作切片(6μm)，用于从免疫组化水平鉴定组织芯片用。之后按文献方法[2，4]操作，将所有蜡块用于制作组织芯片，共制作4套组织芯片蜡块，同时相的三组标本放在同一组织芯片块上，每套两个组织芯片蜡块，每个蜡块含30点阵，每个点直径2mm。 切片：将组织芯片蜡块于切片机上切片(6μm)，漂片黏贴于玻片上于80℃烘烤3h后室温下保存，分别用于HE及胶原纤维染色、免疫组化检测I型胶原纤维。鉴定：肉眼及用胶原纤维染色，观察玻片上各点阵情况，若点阵上各点完整无缺失则组织芯片合格。此外，从免疫组化I型胶原定量比较组织芯片与原蜡块(BLM组)以鉴定组织芯片对原蜡块的代表性。(2)胶原纤维染色：采用显示胶原纤维细胞和肌肉的新染法，按文献方法[5]进行。(3)I型胶原纤维的检侧：用免疫组化法(SP法)，按文献方法[5]操作。(4)图像采集﹑处理及分析定量[2，6]：利用Image-pro plus专业图像分析软件系统，于组织芯片上的每点(包括部份石蜡切片)的左右上下4个视野各采集一张100倍的图像用于图像处理及分析，4张图像的平均值代表该芯片上该指标的量，4套芯片上相对应的同一指标的4点再取平均值，代表该大鼠肺组织的该指标的量：①HE染色，运用图像分析软件的计数功能对图像上的细胞核进行分离然后自动计数细胞核数，每个细胞核代表一个细胞，并与正常对照组细胞数的均数比较，其高出的差值越大，示炎症程度越重。②胶原纤维染色及免疫组化定量总胶原、I型胶原纤维，运用图像分析软件先进行颜色分离，然后自动计算其积分光密度(IOD)； IOD为各个单独探测到的像素光密度的总和，包含了横向的面积和纵向的像素深度，其值越大示所检测指标含量越高。

    1.2.3肺组织TGFβ1mRNA表达的实时荧光定量RT-PCR检测[2，7]

    (1)引物探针：①TGFβ1 上游引物：5’-actactgcttcagctccaca-3’，下游引物：5’-gtgtccaggctccaaatgt -3’,TaqMan探针：5’-ccaagggctaccatgccaac -3’。②内参基因：甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)：上游引物：5’-tgggtgtgaaccacgagaa-3’下游引物：5’-ggcatggactgtggtcatga-3’，TaqMan探针： 5’-ctgcaccaccaactgcttagc-3’。(2)剪取冻存的肺组织50mg-80mg，按Trizol试剂盒说明书操作，提取总RNA并逆转录成cDNA,然后按文献方法[2]进行PCR扩增目的基因：①用假定初始拷贝数的cDNA模板按10倍梯度稀释，制成标准模板系列，自每个稀释模板中取样5μL，分别加入30μL的反应体系中，用FTC-2000型荧光定量基因扩增仪进行PCR以制作标准曲线。②将cDNA样品中各取5μL，在同样的反应条件下行PCR扩增,并测定各样品的Ct值与标准曲线进行比较，得出待侧样品的相对拷贝数。③据上述方法分别计算各个标本待测靶基因和内参基因的相对拷贝数，再将同一样本靶基因除以其内参基因，获得校正后的相对拷贝数，进行统计学分析比较。

    1.3 统计学处理

    实验数据用SPSS 13.0软件行单因数方差分析(ANOVA)，所测数据以±s表示。

    2结 果

    2.1动物表现

    BLM组 (14天及28天)大鼠取食排便活动均减少，LXJ组上述表现不明显，NS组活动取食皆活跃。

    2.2病理改变

    2.2.1肉眼观察 NS组肺表面光滑,呈粉红色 ......

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