RP-HPLC同时测定左金丸中盐酸小檗碱、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量(2)
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参见附件。
C:吴茱萸阴性对照溶液;D:黄连阴性对照溶液
a:盐酸小檗碱，b:吴茱萸碱，c:吴茱萸次碱
2.4标准曲线、检出限和定量限的测定
配制一系列质量浓度梯度的盐酸小檗碱、吴茱萸碱和吴茱萸次碱溶液。在“2.1”项下的色谱条件下取20μL注入高效液相色谱仪并记录盐酸小檗碱、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的色谱峰面积(Y)。以浓度(C)为横坐标，色谱峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程：盐酸小檗碱y=87.028C-254.11(R2=0.9992)，线性范围5.00~500.00μg·mL-1；吴茱萸碱y=150.94C+45.984(R2=0.999)，线性范围1.13~30.00μg·mL-1；吴茱萸次碱y=49.078C+19.911(R2=1) ，线性范围1.25~50.00μg·mL-1。将对照品溶液进行不同程度的稀释并进样分析，当信噪比为3和10时，分别测得各生物碱的检出限和定量限，结果见表2。
2.6稳定性试验
取同一供试品溶液在0、2、4、8、12 h分别进样分析，记录色谱峰面积，计算得盐酸小檗碱RSD为2.96%，吴茱萸碱RSD2.73%，吴茱萸次碱RSD1.78%。结果表明，样品在本实验条件下稳定性良好。
2.7重复性试验
取同一批号的左金丸制备的5份供试品溶液，进样分析，记录色谱图。计算得盐酸小檗碱RSD为2.83%，吴茱萸碱RSD1.95%，吴茱萸次碱RSD1.70%。结果表明，本方法重复性较好。
2.8回收率试验
取已知盐酸小檗碱(91.08mg·g-1)、吴茱萸碱(1.51mg·g-1)、吴茱萸次碱(4.70mg·g-1)含量的左金丸样品5份，各0.10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸小檗碱对照品1.0mL(浓度为1.01mg·mL-1)、吴茱萸碱对照品0.5mL(浓度为0.30mg·mL-1)、吴茱萸次碱对照品0.8mL(浓度为1.00mg·mL-1)于具塞锥形瓶中，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，进样分析，记录色谱图。结果见表3～5。
3 讨 论
本研究对以下参数进行了优化，所确定的分析条件能满足同时检测左金丸中盐酸小檗碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱三种生物碱的要求，可用于左金丸制剂的质量控制。
3.1流动相的优化
实验选用了乙腈-0.05mol·L-1磷酸二氢钾[3]、乙腈-0.05mol·L-1磷酸二氢钾-十二烷基硫酸钠[4]等溶剂系统，结果乙腈-0.3%磷酸-0.3%三乙胺对左金丸中各成分的分离效果较好。
3.2测定波长的选择
经紫外扫描，盐酸小檗碱和吴茱萸次碱在345nm附近均有较强吸收，在215～225nm附近有次强吸收或末端吸收，吴茱萸碱在225nm有较强吸收，在300nm以上几乎无吸收，因此选择225nm作为测定波长[2，5]。
3.3提取方法的优化
比较了加热回流提取方式与超声提取方式，两者都可较好的提取出左金丸中的盐酸小檗碱、吴茱萸碱和吴茱萸次碱，但由于超声提取方式用时较短，较便捷，因此我们选用超声提取。比较了甲醇超声提取时间对盐酸小檗碱、吴茱萸碱和吴茱萸次碱提取率的影响，经超声处理45min，盐酸小檗碱、吴茱萸碱和吴茱萸次碱已提取得比较完全，考虑到提取时间过长，提取液中有关物质较多，故选择45min。
3.4柱温的优化
实验发现，分析物保留时间随柱温升高略有缩短，分离效果有所改善。当柱温在20～30℃时目标峰有杂质干扰，分析时间太长(40min)；在40℃时盐酸小檗碱、吴茱萸碱和吴茱萸次碱可达基线分离，且洗脱时间较适宜(20～30min)。
参考文献
[1] 韩凤梅 ......
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