线粒体ＤＮＡ变异与疾病关系相关性研究(1)
文章编号：1009-5519(2007)15-2290-02 中图分类号：R363 文献标识码：A
线粒体是一个敏感而多变的细胞器，是细胞中能量储存和供给的场所。与核基因相比，线粒体DNA (mtDNA)的突变率高，加之本身缺乏有效的损伤修复系统，所以mtDNA被认为与疾病的发生有密切关系。本文就线粒体基因组改变与糖尿病、衰老、肿瘤、耳聋等疾病的关系作一综述。
1 线粒体DNA简介
mtDNA是人体细胞内惟一的核外遗传物质，呈闭合双链环状结构，长度为16 569 bp。分为编码区和非编码区，编码区共37个基因，编码线粒体内蛋白质合成所必需的22种tRNA，2种rRNA以及形成4种复合物参与氧化磷酸化的13种蛋白多肽. 这些多肽的分别为：复合体Ⅰ(NADH-泛醌还原酶)中7个亚基(ND1，ND2，ND3，ND4，ND4L，ND5，ND6)；复合体Ⅲ(泛醌-细胞色素C还原酶)中1个亚基(Cytb)；复合体Ⅳ(细胞色素C氧化酶，CO)中3个亚基(COⅠ，COⅡ，COⅢ)和复合体V(ATP合酶)中Fo的2个亚基(ATPase6和ATPase8[1])。非编码区位于mtDNA的轻(L)链tRNApro基因和重(H)链tRNApre基因之间，此区L链上有终止结合序列(TSA)，H链起点OH，保守序列段(CSB)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，L链启动子(LSP)和H链启动子(HSP)等，在16024-575核苷酸位点之间非编码区(D-loop)长1 124 bp，既是线粒体DNA转录和复制的起点，又是突变热点。
mtDNA具有非常活跃的自我复制能力，可独立于核DNA之外自主地进行复制、转录和翻译与核DNA不同的是mtDNA的基因结构全部是外显子，没有内含子，散发的DNA突变通常就可导致DNA序列的改变，造成表达蛋白质的变化.线粒体DNA与细胞的氧化磷酸化功能密切相关。人体内90%以上的氧消耗直接与线粒体的呼吸链相联系，线粒体基因编码的蛋白均参与线粒体的氧化过程。在此过程中可产生大量的活性氧(ROS)，当电子传递链功能障碍或机体抗氧化防御系统作用减弱时，线粒体内的自由基不能被有效清除而累积，可使线粒体发生氧化性损伤，从而导致mtDNA的突变。
2各种疾病mtDNA改变及可能致病机制
从突变的类型考虑，线粒体突变主要有：(10点突变：是指某一点的突变改变了进化上高度保守的碱基。(2)缺失：是指mtDNA中部分碱基的丢失。(3)重复突变：是指碱基序列的重复。mtDNA在体内分布广泛，主要分布在人体需能的组织、器官。故它的损害可影响到全身多个器官、系统，所以有关它与疾病的关系受到了学者们的广泛关注，目前，越来越多的研究发现，肿瘤、糖尿病、衰老、耳聋等病的发生发展过程是与线粒体DNA的突变联系在一起的。
2.1 糖尿病：对糖尿病的研究表明：与糖尿病有关的mtDNA位点突变有20余种，其中具有致病作用的是3243A→G突变.后来有人相继报道了3316G→A、3394T→ C位点突变也可以导致糖尿病。有关糖尿病的流行病学调查已显示，增龄是糖尿病的一个危险因素。3316及3394位点均处于线粒体呼吸链的复合体Ⅰ的ND-1基因上，钱杰[2]等认为3316G→A 突变的可能机制是使ND-1亚单位上高度保守的疏水性亮氨酸错译成亲水性苏氨酸，而3394T→ C点突变可使一个中性酪氨酸被亲水性组氨酸取代，从而改变ND-1亚单位的空间构型，影响NADH(CoI)的活性，最终导致ATP合成减少。高血糖能够产生自由基，氧自由基又可以促进mtDNA的损伤。Swoboda等[3]对培养的内皮细胞进行研究，发现高血糖可以增加其mtDNA突变率。Fukagawa等[4]对JCR：LA-CP大鼠肌肉和培养的血管平滑肌细胞进行研究认为高浓度血糖能诱导mtDNA损伤。Liang等[5]对19例55～75岁糖尿病或糖耐量异常患者和17例正常对照进行研究，提出这些患者mtDNA突变率高是由于年龄或高血糖造成的。1995年Cortopassi等[6]完善了Karasik等人提出的细胞凋亡假说：由于大多数线粒体DNA的变异(包括tRNA基因的突变)主要影响ND基因的表达产物，于是便发生了以下可能的连锁反映：线粒体DNA基因缺陷→依赖NDA的复合物Ⅰ功能受损→依赖FDA的复合体Ⅱ通路的过度利用→超氧化物形成增加，又不能及时被锰超氧化物歧化酶清除→具有高毒性的OH 自由基增加→DNA破坏，脂质过氧化，蛋白修饰。这种由OH 自由基引起的DNA破坏可能就是程序性细胞死亡的信号。这个假说较为成功地解释了母系遗传糖尿病胰岛β细胞衰竭可能的发病机制。
2.2 衰老与肿瘤：目前认为，活性氧(ROS)损伤是衰老和肿瘤发生时mtDNA突变的主要原因[7]。Adachi等[8]观察到补充CoQ10可以阻止mtDNA缺失，降低心肌线粒体脂质过氧化水平.这直接证明ROS与mtDNA突变的关系。mtDNA位于线粒体内膜基质侧，临近ROS 产生部位，呼吸链电子传递过程中产生的ROS 易引起mtDNA 氧化损伤。因此，mtDNA比核DNA更易受到氧化损伤.Richter等观察到大鼠肝脏mtDNA 8-羟-脱氧鸟苷水平比核DNA高16倍，而且24月龄大鼠较3月龄大鼠肝脏mtDNA 8-OH-dG 水平高3倍。对人脑的研究也表明mtDNA较核DNA更易受损。Yakes等[9]用200 μM H2O2处理人纤维原细胞15分钟或60分钟，发现mtDNA损伤程度比核DNA高3倍。而且，1.5小时后核DNA损伤可以修复，但mtDNA没有被修复的迹象。这表明氧化损伤对mtDNA作用更严重，持续时间更长。脱氧鸟苷(dG)向8-OH-dG含量之间有明显的相关[10]。研究表明8-OH-dG通常应编码胞嘧啶，但它有1%的几率单一突变同腺嘌呤配对[11]。8-OH
-dG还可以造成临近残基的错读。
有研究报道线粒体特有的聚合酶γ在合成DNA时错配率较高.聚合酶γ是线粒体中存在的惟一的DNA聚合酶，负责mtDNA的复制和修复。Pinz 等研究了聚合酶γ对线粒体中两种常见的损伤-脱碱基损伤和氧化损伤(发生率在线粒体中是核中的10倍以上)的作用，发现聚合酶γ的3'～5'外切酶活性不能十分有效地矫正这两种损伤造成的不正常配对，这可能是mtDNA突变率高的一个原因[12]。但对这一点存在争论。mtDNA只有一套很不完整的自我修复系统，缺乏DNA保护蛋白如组蛋白，以及线粒体DNA有大量的正向重复，这些都增加了mtDNA突变的可能性[13]。
mtDNA可以稳定地整合到核基因组中[16～18]，因此国内外很多研究人员把“整合”作为了mtDNA诱发癌变可能途径之一，具体机制大概如下：mtDNA在发生复制错误、重组和缺失、自身受损而短期内大量崩解，使细胞之中产生过多的mtDNA片段，由于溶酶体内DNA水解酶的水解不完全，以及细胞质中DNA酶活性下降，使得mtDNA片段像病毒一样穿过核孔，随机整合到核基因组织导致以下两个结果：(1)激活原癌基因和(或)抑制抑癌基因活性，使细胞增殖分化失控，导致癌变。(2)改变细胞能量的产生，提高线粒体氧化压力引起线粒体酶表达异常和(或)激活抗凋亡基因和抑制凋亡基因，使细胞正常凋亡失控，进而无限增殖。
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线粒体是一个敏感而多变的细胞器，是细胞中能量储存和供给的场所。与核基因相比，线粒体DNA (mtDNA)的突变率高，加之本身缺乏有效的损伤修复系统，所以mtDNA被认为与疾病的发生有密切关系。本文就线粒体基因组改变与糖尿病、衰老、肿瘤、耳聋等疾病的关系作一综述。
1 线粒体DNA简介
mtDNA是人体细胞内惟一的核外遗传物质，呈闭合双链环状结构，长度为16 569 bp。分为编码区和非编码区，编码区共37个基因，编码线粒体内蛋白质合成所必需的22种tRNA，2种rRNA以及形成4种复合物参与氧化磷酸化的13种蛋白多肽. 这些多肽的分别为：复合体Ⅰ(NADH-泛醌还原酶)中7个亚基(ND1，ND2，ND3，ND4，ND4L，ND5，ND6)；复合体Ⅲ(泛醌-细胞色素C还原酶)中1个亚基(Cytb)；复合体Ⅳ(细胞色素C氧化酶，CO)中3个亚基(COⅠ，COⅡ，COⅢ)和复合体V(ATP合酶)中Fo的2个亚基(ATPase6和ATPase8[1])。非编码区位于mtDNA的轻(L)链tRNApro基因和重(H)链tRNApre基因之间，此区L链上有终止结合序列(TSA)，H链起点OH，保守序列段(CSB)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，L链启动子(LSP)和H链启动子(HSP)等，在16024-575核苷酸位点之间非编码区(D-loop)长1 124 bp，既是线粒体DNA转录和复制的起点，又是突变热点。
mtDNA具有非常活跃的自我复制能力，可独立于核DNA之外自主地进行复制、转录和翻译与核DNA不同的是mtDNA的基因结构全部是外显子，没有内含子，散发的DNA突变通常就可导致DNA序列的改变，造成表达蛋白质的变化.线粒体DNA与细胞的氧化磷酸化功能密切相关。人体内90%以上的氧消耗直接与线粒体的呼吸链相联系，线粒体基因编码的蛋白均参与线粒体的氧化过程。在此过程中可产生大量的活性氧(ROS)，当电子传递链功能障碍或机体抗氧化防御系统作用减弱时，线粒体内的自由基不能被有效清除而累积，可使线粒体发生氧化性损伤，从而导致mtDNA的突变。
2各种疾病mtDNA改变及可能致病机制
从突变的类型考虑，线粒体突变主要有：(10点突变：是指某一点的突变改变了进化上高度保守的碱基。(2)缺失：是指mtDNA中部分碱基的丢失。(3)重复突变：是指碱基序列的重复。mtDNA在体内分布广泛，主要分布在人体需能的组织、器官。故它的损害可影响到全身多个器官、系统，所以有关它与疾病的关系受到了学者们的广泛关注，目前，越来越多的研究发现，肿瘤、糖尿病、衰老、耳聋等病的发生发展过程是与线粒体DNA的突变联系在一起的。
2.1 糖尿病：对糖尿病的研究表明：与糖尿病有关的mtDNA位点突变有20余种，其中具有致病作用的是3243A→G突变.后来有人相继报道了3316G→A、3394T→ C位点突变也可以导致糖尿病。有关糖尿病的流行病学调查已显示，增龄是糖尿病的一个危险因素。3316及3394位点均处于线粒体呼吸链的复合体Ⅰ的ND-1基因上，钱杰[2]等认为3316G→A 突变的可能机制是使ND-1亚单位上高度保守的疏水性亮氨酸错译成亲水性苏氨酸，而3394T→ C点突变可使一个中性酪氨酸被亲水性组氨酸取代，从而改变ND-1亚单位的空间构型，影响NADH(CoI)的活性，最终导致ATP合成减少。高血糖能够产生自由基，氧自由基又可以促进mtDNA的损伤。Swoboda等[3]对培养的内皮细胞进行研究，发现高血糖可以增加其mtDNA突变率。Fukagawa等[4]对JCR：LA-CP大鼠肌肉和培养的血管平滑肌细胞进行研究认为高浓度血糖能诱导mtDNA损伤。Liang等[5]对19例55～75岁糖尿病或糖耐量异常患者和17例正常对照进行研究，提出这些患者mtDNA突变率高是由于年龄或高血糖造成的。1995年Cortopassi等[6]完善了Karasik等人提出的细胞凋亡假说：由于大多数线粒体DNA的变异(包括tRNA基因的突变)主要影响ND基因的表达产物，于是便发生了以下可能的连锁反映：线粒体DNA基因缺陷→依赖NDA的复合物Ⅰ功能受损→依赖FDA的复合体Ⅱ通路的过度利用→超氧化物形成增加，又不能及时被锰超氧化物歧化酶清除→具有高毒性的OH 自由基增加→DNA破坏，脂质过氧化，蛋白修饰。这种由OH 自由基引起的DNA破坏可能就是程序性细胞死亡的信号。这个假说较为成功地解释了母系遗传糖尿病胰岛β细胞衰竭可能的发病机制。
2.2 衰老与肿瘤：目前认为，活性氧(ROS)损伤是衰老和肿瘤发生时mtDNA突变的主要原因[7]。Adachi等[8]观察到补充CoQ10可以阻止mtDNA缺失，降低心肌线粒体脂质过氧化水平.这直接证明ROS与mtDNA突变的关系。mtDNA位于线粒体内膜基质侧，临近ROS 产生部位，呼吸链电子传递过程中产生的ROS 易引起mtDNA 氧化损伤。因此，mtDNA比核DNA更易受到氧化损伤.Richter等观察到大鼠肝脏mtDNA 8-羟-脱氧鸟苷水平比核DNA高16倍，而且24月龄大鼠较3月龄大鼠肝脏mtDNA 8-OH-dG 水平高3倍。对人脑的研究也表明mtDNA较核DNA更易受损。Yakes等[9]用200 μM H2O2处理人纤维原细胞15分钟或60分钟，发现mtDNA损伤程度比核DNA高3倍。而且，1.5小时后核DNA损伤可以修复，但mtDNA没有被修复的迹象。这表明氧化损伤对mtDNA作用更严重，持续时间更长。脱氧鸟苷(dG)向8-OH-dG含量之间有明显的相关[10]。研究表明8-OH-dG通常应编码胞嘧啶，但它有1%的几率单一突变同腺嘌呤配对[11]。8-OH
-dG还可以造成临近残基的错读。
有研究报道线粒体特有的聚合酶γ在合成DNA时错配率较高.聚合酶γ是线粒体中存在的惟一的DNA聚合酶，负责mtDNA的复制和修复。Pinz 等研究了聚合酶γ对线粒体中两种常见的损伤-脱碱基损伤和氧化损伤(发生率在线粒体中是核中的10倍以上)的作用，发现聚合酶γ的3'～5'外切酶活性不能十分有效地矫正这两种损伤造成的不正常配对，这可能是mtDNA突变率高的一个原因[12]。但对这一点存在争论。mtDNA只有一套很不完整的自我修复系统，缺乏DNA保护蛋白如组蛋白，以及线粒体DNA有大量的正向重复，这些都增加了mtDNA突变的可能性[13]。
mtDNA可以稳定地整合到核基因组中[16～18]，因此国内外很多研究人员把“整合”作为了mtDNA诱发癌变可能途径之一，具体机制大概如下：mtDNA在发生复制错误、重组和缺失、自身受损而短期内大量崩解，使细胞之中产生过多的mtDNA片段，由于溶酶体内DNA水解酶的水解不完全，以及细胞质中DNA酶活性下降，使得mtDNA片段像病毒一样穿过核孔，随机整合到核基因组织导致以下两个结果：(1)激活原癌基因和(或)抑制抑癌基因活性，使细胞增殖分化失控，导致癌变。(2)改变细胞能量的产生，提高线粒体氧化压力引起线粒体酶表达异常和(或)激活抗凋亡基因和抑制凋亡基因，使细胞正常凋亡失控，进而无限增殖。
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