陈恒君，田超群，杨钰兴，袁睿(重庆市渝北区人民医院：.皮肤科；.泌尿外科400)

    恶性黑素瘤是由皮肤、黏膜、眼等色素沉着部位的黑素细胞产生的一种高度恶性肿瘤，其特点为生长隐匿、转移早且迅速，患者预后差及病死率高，致死率达79.0%[1?3]。目前，已确定小眼畸形相关转录因子(MITF)在黑素细胞和黑素瘤细胞核中高表达[4?5]，是核蛋白最重要的转录因子，具有较强的诊断灵敏度和特异性[6?7]，但相关机制研究较少。本研究采用RNA干扰技术，研究了MITF对恶性黑素瘤的生长及黑素生成能力的影响，试图为恶性黑素瘤的治疗提供新的思路和策略，现报道如下。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株 pLKO.1?短发夹RNA(shRNA)载体。

    1.1.2 细胞系 B16F10黑素瘤细胞系购自KeyGen公司。细胞生长基质(培养液 1)为 RPMI?1640、10% 胎牛血清。细胞培养箱条件为37℃及5%二氧化碳。

    1.1.3 主要试剂 RPMI?1640、10%胎牛血清均购自HyClone公司；mRNA提取试剂盒Trizol Reagent、逆转录试剂盒 PrimeScript?RT reagent Kit、扩增试剂盒SYBR Green RT?PCR Kit均购自 TaKaRa公司；蛋白抽提试剂盒、蛋白质印迹跑胶试剂盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、蛋白质印迹显影ECL化学发光试剂盒、Tri?ton?X100、MTT细胞活性检测试剂盒均购自Beyotime公司；蛋白定量试剂盒采用Pierce?BCA Protein Assay Kit，购自Thermo Scientific公司；免疫组织化学试剂盒购自博士德公司；MITF、β?actin蛋白抗体均购自Santa公司；DNA Marker、RNA Marker、LipofectamineTM2000均购自Invitrogen公司；嘌呤霉素购自Sigma公司；MITF?shRNA质粒由KeyGen公司构建，并根据片段不同分别标注为 B16F10?NC(空白质粒对照)、B16F10?1、B16F10?2、B16F10?3，另建立未用任何质粒转染的阴性对照(B16F10组)。

    1.2 方法

    1.2.1 构建稳定干扰MITF表达的B16F10细胞系 将对数生长期B16F10细胞系传代并过夜(约24 h)培养，按标准流程，使用LipofectamineTM2000将扩增的shR?NA质粒中MITF沉默片段转染该细胞系。48 h后 ...... 濠碘€冲€归悘澶愬箖閵娿儲韬ù锝堟硶閺併倝骞嶇€ｎ偅绨氱紒娑橆槹缁侊妇鎲撮崼鐔割槯闁哄啰濮电涵鍫曞蓟閵壯勭畽闁瑰瓨鐗旂粭鍛姜閽樺寮块柡鍌氭祫缁辨繈宕ｉ婵嗗幋闁哄嫷鍨甸～锕傚箹濠婂懎鍋嶇€殿喗娲橀幖鍛婂緞鏉堚晜鍩傞柍銉︾矎濞村棝鎯嶆担娴嬪亾濠垫挾绀夐悹鍥棑閸嬶綁宕欑拠鑼綄妤犵偞娲樺〒鑸电▔鐎ｎ偅鐓欓柣銊ュ閳ь剚绮庨弫鎼佹嚇閹寸姴顣奸柍銉︾箖閸ㄣ劑鍨惧⿰鍐ㄦ枾缂傚啯鍨块妴澶愬灳濠靛⿴鍟忛梻鍌ゅ枔閳ь剨鎷�


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