金 鑫，余福勋，杨 丽，余本莉，崔玉霞，叶芝旭,△

    (1.贵州省人民医院眼科，贵州 贵阳 550002；2.贵州省人民医院中心实验室/国家卫生健康委员会肺脏免疫疾病重点实验室，贵州 贵阳550002；3.贵州省人民医院儿科，贵州 贵阳 550002)

    呼吸道合胞病毒(RSV)是全世界婴幼儿和老年人病毒性呼吸道感染的主要原因，其每年造成的死亡人数超过流感。几乎所有2岁以下儿童均感染过RSV。严重的RSV感染与儿童反复喘息及哮喘有关[1-2]。因此，RSV感染越来越受到重视，研究RSV致病机制、研发抗RSV药物及疫苗均需进行RSV滴度定量测定。空斑形成试验是测定病毒滴度的“金标准”，在国内外已得到广泛应用。与甲基纤维素相比，琼脂糖更容易覆盖细胞单层[3-4]，但方法不当时，不易形成空斑。本研究应用琼脂糖覆盖细胞单层、中性甲醛固定及中性红染色的试验流程检测病毒滴度，能形成合适的空斑，方法简单且重复性较好，为进一步进行RSV相关基础研究打下了基础。

    1 材料与方法

    1.1主要材料 人喉上皮癌细胞Hep-2及RSV A2标准株由重庆医科大学附属儿童医院呼吸病研究室惠赠。胎牛血清购自澳大利亚AusGeneX公司；DMEM液体培养基和干粉培养基分别购自美国Gibco公司和Hyclone公司；Triton X-100、BSA、中性红、胰酶和低熔点琼脂糖购自北京Solarbio公司；鼠抗RSV N抗体购自英国ABCam公司；异硫氰酸荧光素(FITC)标记的小鼠抗荧光二抗购自北京Bioss公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)购自上海碧云天公司。

    1.2方法

    1.2.1RSV感染细胞模型的建立 未感染RSV的Hep-2细胞作为空白对照组，感染RSV的Hep-2细胞作为试验组，每组4个孔。Hep-2细胞按6×105/孔铺板于12孔板中，待细胞单层生长至80%时，将感染复数为0.01的病毒液[用含2%胎牛血清(FBS)的DMEM稀释病毒液]按每孔400 μL加入细胞中 ......