李欣怡，孙雪梅，付 灿，岳鹏鹏，于鸿浩，李 勇

    (桂林医学院生物技术学院，广西 桂林 541199)

    CRISPR系统是从细菌中发现的天然免疫系统，当病毒入侵时，该系统可改变外来基因组，以保护细菌细胞免受外来基因侵害。CRISPR/Cas9系统是由Ⅱ型CRISPR系统变化来的，使用CRISPR/Cas9技术可进行基因定向敲除、插入操作。与传统技术比较，其优势在于设计构建较为简单、操作简易、成本低、编辑效率高、可同时打靶多个基因等。基于CRISPR/Cas9的转基因技术已广泛应用于诸多领域，对人类产生了深远影响，有利于推动医药、育种等领域的快速发展[1-2]。

    威尔逊病(WD)的全球患病率约为1/30 000，致病基因携带率约为1/90，在中国比较常见，是由铜转运P型三磷酸腺苷(ATP)酶基因突变引起[3]。WD的临床特点是代谢损伤会导致铜在各种组织(主要是肝脏和大脑)中的有毒积累，从而导致复杂的临床表现，如神经系统症状、肝硬化恶化、肾脏损伤、角膜色素环和其他症状[4-5]，严重危害人类健康。本研究通过NCBI ClinVar等数据库比对分析，发现c.2333G>T(p.Arg778Leu)突变是中国人群突变的热点[6-7]，故使用CRISPR/Cas9系统稳定编辑小鼠ATP7B基因c.2333G>T位点(p.Arg778Leu)，建立高效、可模拟人ATP7B致病突变的小鼠ATP7B CRISPR/Cas9基因编辑系统，为进一步构建小鼠ATP7B基因突变动物模型奠定基础，也对精准模拟WD、深入理解WD的致病机制及探索可行的治疗策略具有重要意义。

    1 材料与方法

    1.1材料

    1.1.1细胞株、菌株和质粒 大肠杆菌感受态菌株DH5α购于北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司；小鼠脑神经瘤N2a细胞由广州大学周建奎博士惠赠；pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin (addgene#51133)和Cas9表达质粒pST1374-NLS-flag-linker-Cas9(addgene#44758)均由上海科技大学黄行许教授惠赠。T载体(pMDTM19-T Vector Cloning Kit)购于宝日医生物技术(北京)有限公司。

    1.1.2试剂及仪器 TransDirect?Animal Tissue PCR Kit(AD201-01)购于北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司；去内毒素质粒中提试剂盒(CW2105)购于北京康为世纪生物科技有限公司；DNA纯化回收试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司；TaKaRa TaqTM(R001A)、Premix Taq均购于宝日医生物技术(北京)有限公司；Bsa Ⅰ购于NEB公司；Lipo fectamineTM3000 Transfection Reagent(InvitrogenTM)试剂盒、DMEM培养基、胎牛血清、杀稻瘟霉素和嘌呤霉素均购于赛默飞世尔科技公司；引物合成及DNA测序由北京擎科生物科技有限公司完成 ......