张芷源 综述,丁 明 审校

    (中国药科大学生命科学与技术学院,江苏 南京 210009)

    细胞是生命的最小单位,而蛋白质是生命物质的基础。在细胞中蛋白质之间通常会形成复合物及构建对维持细胞结构、功能完整至关重要的相互作用网络来控制不同的生理生命过程。为了解释这些过程,研究蛋白质的相互作用、蛋白质作用的时间及空间分布则尤为重要。蛋白质-蛋白质的相互作用(PPI)与生物功能的执行及疾病的发生发展密切相关。探索隐藏于复杂的细胞信号通路及调控网络下的PPI则需要克服诸多传统方法的技术缺陷。常见的研究蛋白互作体的方法有亲和纯化-质谱(AP-MS)和酵母双杂交[1-2]。利用基于AP技术的方法需要裂解细胞并且受限于纯化方式,即使可以纯化也会容易出现假阳性的鉴定污染,并且在蛋白互作体纯化过程中由于严格的洗涤,那些短暂而微弱的相互作用可能会消失[3]。而酵母双杂交试验只能提示2种蛋白质的潜在相互作用,而不是实际发生在体内的相互作用[3]。

    而基于酶的邻近依赖标记技术是一种新的PPI筛选方法,随着这项技术的不断发展可以一定程度上弥补传统手段的不足。邻近标记技术(PL)通过将具有标记功能的工程酶与感兴趣蛋白(诱饵蛋白)融合,工程酶就可以将目的蛋白邻近以及潜在互作的蛋白(猎物蛋白)进行共价标记。目前,工程酶主要有3种:辣根过氧化物酶(HRP)、生物素连接酶(BirA)、工程抗坏血酸过氧化物酶(APEX)[4]。而利用BirA及其突变体的邻近依赖生物素鉴定(BioID)可以鉴定传统方法容易忽略的瞬时、微弱的相互作用。随着BioID技术的飞速发展,应用更具有优势的BirA突变体的技术例如TurboID、miniTurboID及Split-TurboID,能够更加快速、简单、可靠地了解蛋白质相互作用并解释其分子功能。本文主要对TurboID邻近依赖生物素鉴定技术的研究进展进行归纳总结,阐述其技术原理和在疾病蛋白质组学中的重要作用。

    1 邻近依赖生物素鉴定技术的策略

    邻近依赖生物素鉴定技术是一种基于生物素连接酶(BirA)的邻近标记技术。BirA是一种保守的酶,相对分子质量大约为35.5 kDa,来源于大肠杆菌,介导生物素与目标蛋白结合[5]。BirA在ATP存在的情况下,催化生物素形成活性biotinoyl-5′-AMP中间体并将其保持在酶活性中心,活性biotinoyl-5′-AMP从活性位点脱离后转移到靶蛋白的邻近蛋白表面的伯胺赖氨酸上,实现蛋白质生物素化。由于BirA对其靶序列有很高的特异性,其已被用于研究特定的蛋白质-蛋白质相互作用:BirA融合到诱饵蛋白上,生物素受体肽(BAP)融合到猎物蛋白上,如果它们之间能够发生相互作用,猎物蛋白将因为足够接近诱饵蛋白而被生物素化 ......