高效液相色谱法测定刺楸总皂苷中刺楸皂苷A的含量
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【摘要】本文采用大孔树脂法制备了一定量的刺楸总皂苷，并采用高效液相色谱法，以乙腈-0.05%磷酸溶液(55:45)为流动相，203nm为检测波长，以活性成分刺楸皂苷A为指标对三批刺楸总皂苷进行了含量测定，按外标法测得刺楸皂苷A的平均含量为9.66mg/g，为刺楸的进一步开发提供了实验数据。
【关键词】刺楸；总皂苷；皂苷A；含量测定
【中图分类号】R927.2 【文献标识码】B 【文章编号】1009-6019(2008)-03-0077-1
刺楸生长于山坡杂木林中，分布于全国各省区，以根、根皮或树皮入药[1]，刺楸为五加科植物Kalopanaxseptemlobus(Thunb.)Koidz.，1977年版《中国药典》(一部)中以“川桐皮”收载[2]。具有祛风、除湿、通络、杀虫之功效，临床用于治疗各种风湿痹证、腰膝疼痛等。通过研究发现，刺楸总皂苷具有抗炎活性，其中刺楸皂苷A是其中的主要活性成分，具有抗肿瘤、抗菌、抗炎等活性。为进一步开发刺楸药用资源，本章采用大孔树脂法制备了刺楸总皂苷，并选择刺楸皂苷A作为含量测定的指标，采用高效液相色谱法对刺楸总皂苷中的刺楸皂苷A进行了含量测定研究，效果满意，现报道如下。
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1仪器与材料
SSI/HPLC系统，EZchromElite色谱工作站，sartoriusBT25S精密电子天平，721B型分光光度计，D101、AB-8、D4020大孔树脂(天津南开大学化工厂)，乙腈、甲醇为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。刺楸皂苷A为自制对照品(结构经1H-NMR及13C-NMR鉴定)，纯度经HPLC面积归一化法测定大于98.5%。
2刺楸总皂苷的制备
2.1总皂苷的含量测定
2.1.1标准曲线的绘制
精密称取刺楸皂苷A对照品8.0mg，用甲醇溶解并定容至5mL，分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，置25mL具塞试管中，然后加入甲醇使终体积为1.0mL。另取1.0mL甲醇作为空白对照。在各管中依次加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.8mL，摇匀后置60℃水浴中加热15min，取出后迅速用流水冷却至室温，再分别加入5mL冰醋酸，摇匀，于203nm处测定吸光度。以浓度(C)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标进行线性回归，得回归方程A=0.0042C-0.0356(r=0.9988)，表明刺楸皂苷A在45.71～228.55μg/mL范围内浓度与吸光度呈良好的线性关系。实验结果见表1，标准曲线见图1。
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2.1.2样品中总皂苷的测定
精密称取经大孔树脂洗脱后的样品10mg，用甲醇溶解并定容至5mL，取1mL置于25mL具塞试管中，按2.1.1项操作，测定样品的吸光度值，根据标准曲线计算总皂苷的含量。
2.2上柱液的制备
取刺楸粗粉100g，加6倍量80%乙醇提取3次，时间为3h、2.5h、2h，合并提取液，回收乙醇至无醇味，将浓缩物加蒸馏水溶解，过滤，备用。
2.3树脂类型的选择
2.3.1不同型号树脂对刺楸总皂苷的静态吸附量试验
精密称取已处理好的D101、AB-8、D4020湿树脂各1.0g，置100mL烧杯中，加样品液40mL，振摇20min，静置24h，使其达到饱和吸附量。试验结果见表2。
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饱和吸附量=(初始浓度-吸附后浓度)×吸附液体积/湿树脂量
2.3.2不同树脂对刺楸总皂苷静态吸附—洗脱性能试验
将2.3.1中的3种树脂饱和吸附后滤出，精密加入80%乙醇溶液20mL，振摇20min，放置2h，测定洗脱液的浓度，计算洗脱率。试验结果见表3。
洗脱率=[洗脱液浓度×洗脱液体积/饱和吸附量]×100%
结果表明，D101、AB-8、D4020型3种大孔树脂对刺楸总皂苷的吸附性能均较好，饱和吸附量无明显差异。而在静态洗脱中，D101型树脂吸附的总皂苷洗脱率达86.06%，高于其他两种树脂，故选择D101型树脂作为纯化刺楸总皂苷的树脂。
2.4乙醇洗脱梯度的选择
, 百拇医药 将刺楸提取液通过D101型大孔树脂柱，依次用3倍柱体积的30%、60%、70%、80%及95%乙醇洗脱，将洗脱液分别蒸干，用甲醇溶解并定容，分别测定洗脱液中刺楸总皂苷的含量(见图3.2)。结果表明，随着乙醇浓度的提高，皂苷洗脱率相应提高，这是由于乙醇浓度越高，越有助于解吸。但是，70%、80%、95%乙醇的洗脱率差别不明显，从实验成本考虑，最终选择洗脱条件为：先用30%乙醇洗去大量杂质，再用80%乙醇洗脱，收集洗脱部分，即得刺楸总皂苷。
2.5工艺验证实验
结合文献报道及作者的实验研究，最终确定了刺楸总皂苷的最佳制备工艺：采用6倍量80%乙醇回流提取3次，时间为3h、2.5h、2h，提取液合并，回收乙醇至无醇味，将浓缩物加蒸馏水溶解，过滤。滤液缓缓通过已处理好的D101型大孔树脂，用蒸馏水洗至洗脱液无糖反应，用2倍柱体积的30%乙醇洗脱后，再用2～3倍柱体积的80%乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇并浓缩，干燥，即得刺楸总皂苷。为了考察该制备工艺的稳定性，分别采用该法制备了3批刺楸总皂苷，通过含量测定及TLC法检查(对照品为刺楸皂苷A)发现，该工艺稳定可行。工艺验证实验结果见表4，TLC检查结果见图3。
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CHCl3-MeOH-H2O(65:35:10，下层)为展开剂；10%硫酸乙醇加热显色
3刺楸皂苷A的含量测定
3.1色谱条件
KromasilC18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：乙腈-0.05%磷酸溶液(55:45)；检测波长为203nm；柱温室温，流速1.0mL/min，进样10μL。对照品和样品的液相色谱图见图4和图5。
3.2对照品溶液的制备
精密称取刺楸皂苷A对照品适量，加流动相溶解并定量稀释制成每1mL含刺楸皂苷A0.85mg的溶液，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为对照品溶液。
3.3供试品溶液的制备
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精密称取刺楸总皂苷1.0g，置10mL容量瓶中，加流动相超声溶解并稀释至刻度，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
3.4线性范围考察
精密称取对照品适量制成0.21mg/mL，0.43mg/mL，0.85mg/mL，1.23mg/mL，1.44mg/mL的对照品溶液，按色谱条件进样分析，以进样量(μg)为横坐标、峰面积(A)为纵坐标进行线性回归，得到回归方程为：Y＝4.19×104X-7.35×103(r=0.9997)，表明刺楸皂苷A在2.1～14.4μg范围内进样量与峰面积呈良好的线性关系。
3.5精密度试验
取同一供试品溶液，按色谱条件，重复进样5次，计算刺楸皂苷A的平均峰面积为387760，RSD值为0.08%，表明方法的精密度良好。
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3.6稳定性试验
取同一供试品溶液，按色谱条件，在0，2，4，6，8h分别进样，计算刺楸皂苷A的平均峰面积为387903，RSD值为0.02%，表明供试品溶液至少在8h内稳定。
3.7重复性试验
取同一批样品，按供试品溶液方法平行制备5份供试品溶液，按色谱条件进行测定，计算刺楸皂苷A的平均含量为9.67mg/g，RSD值为0.10%，表明方法的重复性良好。
3.8加样回收率试验
精密称取已知含量(9.67mg/g)的样品9份，每份0.5g，分别精密加入刺楸皂苷A对照品适量，按供试品溶液制备方法制备，按色谱条件测定含量。计算刺楸皂苷A的平均回收率为98.98%，RSD值为0.27%。
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3.9样品测定
取3批刺楸总皂苷样品，制备供试品溶液，按色谱条件进行测定，按外标法计算刺楸皂苷A的平均含量为9.66mg/g，RSD值为0.13%。结果见10。
4讨论
刺楸总皂苷中成分比较复杂，本研究采用HPLC法对刺楸总皂苷中的活性成分刺楸皂苷A进行了定量分析。结果表明，当流动相为乙腈-0.05%磷酸溶液(55:45)，检测波长为203nm时分离效果较好。该法简便、准确，适合于刺楸总皂苷中刺楸皂苷A的含量测定。
4结果与讨论
4.1结果
采用大孔树脂法制备了一定量的刺楸总皂苷，并采用高效液相色谱法测定了3批刺楸总皂苷中活性成分刺楸皂苷A的含量，结果表明，平均含量为9.6mg/g。
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4.2讨论
采用大孔吸附树脂法制备了一定量的刺楸总皂苷。文献报道，刺楸皂苷A具有抗肿瘤等活性，因此作者选择刺楸皂苷A作为刺楸总皂苷的含量测定指标，对其进行了含量测定研究，为刺楸总皂苷的药用开发提供了实验数据，具有一定的应用价值。
参考文献:
[1]《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编(上册)[M].北京:人民卫生出版社,1976:487-488
[2]中华人民共和国卫生部药典委员会编.中华人民共和国药典[S].一九七七年版,北京,p60-61., 百拇医药(孙振学 石 岩 尹建元)