蔡海莺 沈灵智 赵敏洁 李 杨 毛建卫 冯凤琴*

    (1 浙江科技学院生物与化学工程学院 杭州 310023 2 浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心 杭州310023 3 浙江大学生物系统工程与食品科学学院 杭州 310058)

    sn-1，3 专一性脂肪酶是指特异性水解甘油三酯1，3 位酯键的脂肪酶，因其特异性的催化性能，可修饰甘油酯中脂肪酸的组成和分布，是酶法合成功能性结构脂的关键原料之一，已被广泛应用于1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯 (OPO)、类可可脂、1，3-甘二酯和易消化中链脂肪酸结构脂[1-2]。米黑根毛霉脂肪酶(RML)具有较高的比酶活性、热稳定性、溶剂耐受性以及很好的sn-1，3位置专一性等一系列适合工业化推广的特点，因而备受青睐[1]，该基因米曲霉宿主异源表达的重组脂肪酶应用范围最广[3]。诺维信公司固定化的RML 脂肪酶RM IM 在母乳化结构油脂OPO 的酶法合成应用中，展现出极佳的合成效率和市场潜力。然而，该酶制剂价格较高，限制了其在食品工业和油脂加工中的进一步发展。

    随着生物学技术水平的提高，通过生物工程方法对脂肪酶进行表达和分子改造，是目前常用的降低酶生产成本的策略之一[4-5]。巴斯德毕赤酵母(Pachia pastoris)表达系统因其高效表达和分泌，易于基因工程改造，培养发酵操作体系成熟等优点，已成为目前使用最广泛的真核表达系统[6]。相较于大肠杆菌表达系统，具有更高的安全性，以及更好的蛋白翻译后糖基化修饰能力等。在巴斯德毕赤酵母中获得成功表达的重组蛋白超过600种，其中，Werten[7]通过蛋白酶缺陷株表达明胶，实现了巴斯德毕赤酵母最高的分泌蛋白表达水平14.8 g/L；Hasslacher 等[8]1997年对热带橡胶的羟基腈裂解酶在巴斯德毕赤酵母细胞内进行表达，最终胞内该异源蛋白表达水平达到惊人的22 g/L，为胞内可溶性蛋白的50%以上，是目前已报道的最高的巴斯德毕赤酵母重组表达蛋白。工业化水平的巴斯德毕赤酵母重组表达已较为成熟。

    外源基因的重组表达往往需要进行基因优化和设计，以获得更理想的重组表达水平[9]。蛋白的分子改造过程是提高酶的催化性能和稳定性等特征的有效手段，分子改造的策略包括定向进化、理性设计和半理性设计[10-11]。对RML 脂肪酶氨基酸序列的分析表明，成熟肽196 和197 氨基酸残基(RML 前体全序列的第291 和292 位)为“-Arg-Arg-”，是潜在的Kex2 酶切位点，可能导致脂肪酶蛋白在毕赤酵母重组表达过程中被宿主裂解。本研究利用巴斯德毕赤酵母重组表达系统 ......