邱丹腾 张海玲 刘树滔* 林士森 陈玲琳 饶平凡

    (1 福州大学生物工程研究所 福州350108 2 中国科学院上海生命科学研究院-浙江工商大学食品营养科学联合研究中心 杭州310035)

    传统的微生物分离、 分析方法是建立在纯培养技术上发展起来的，如平板涂布法、平板划线分离法以及稀释混合平板法。 然而这些传统方法不但分离周期长、操作繁琐，而且难以得到绝对的纯种，并且对于难培养和不可培养的微生物而言，这些方法并不适用[1-2]。 随着分子生物学技术的快速发展，克服了传统培养方法的限制，可以从基因的水平定量分离、分析微生物，主要包括免疫磁性颗粒分离技术[3-4]、场流分离技术[5]、实时荧光定量PCR 技术[6-7]以及PCR-DGGE 技术[8-10]等，这些技术具有高效、快速、操作简单等优点，能够大大提高微生物分离、 分析的效率， 缩短研究周期[11]。PCR-DGGE 技术是近年来国内外应用较为广泛的分子生物学技术之一， 它不仅可以通过对电泳图谱的观察来判定微生态系统的多样性和相似性，而且还可以通过对差异条带进行胶回收、克隆和测序完成定性分析。 然而DGGE 技术存在一定的局限性，它只能对单条带进行测序分析，无法完全将有序列差异的DNA 片段分开，从而出现不同序列DNA 的共迁移现象，给条带回收和测序带来困难[11-13]。 条带回收及其测序过程不仅试验周期长，还费力耗材。分子生物学技术普遍存在干扰成分多， 检测灵敏度和准确性受限以及无法回收菌体细胞，无法分析菌体表面特性，检测样品制备繁琐等问题。

    高效液相色谱技术是微生物分离、 分析和制备方法的一种创新性选择。细菌作为带电颗粒，具有不同的表面带电特性， 其细胞表面的羧基、氨基、 磷酸等基团在不同的pH 条件下会发生电离，细菌可以像生物大分子一样， 利用离子交换色谱技术进行分离[14-15]。高效液相色谱技术作为一种快速、灵敏的崭新手段已应用于青枯菌、金黄色葡萄球菌、 致泻性大肠杆菌以及动物肠道菌群等的初步分析，该方法不仅能以细菌细胞的种类、鞭毛长短、致病力的强弱而分离成不同的色谱组分，还能将不同生长阶段的细菌细胞分离[16-20]。

    本文选取红曲作为模式体系， 通过红曲细菌样品制备条件优化， 应用HPLC 技术分离红曲生产菌株， 回收菌体细胞并结合PCR-DGGE 技术，利用细菌16S rDNA 对色谱分离得到的菌株进行鉴定。 探讨HPLC 技术在红曲细菌分离、分析中的应用潜力，为复杂微生物体系的分离、分析提供新思路， 为发酵食品生产菌株的筛选和制备提供新方法 ......